Methodenentwicklung zur Herstellung cisgener Apfelpflanzen

Abstract

Die vorliegende Dissertation behandelt die Entwicklung von Methoden zur Herstellung cisgener Apfelpflanzen. Da die klassische Apfelzüchtung ein langwieriger Prozess ist, bietet das kürzlich vorgestellte cisgenetische Konzept eine vielversprechende Möglichkeit, um resistente Apfelsorten in relativ kurzer Zeit zu produzieren. Die Hauptziele der vorliegenden Arbeit sind: (1) die Entwicklung eines cisgenetischen Ansatzes unter Verwendung eines Clean Vector Technologie Verfahrens auf Basis eines hitzeinduzierbaren Flp/FRT Rekombinasesystems; (2) die Identifizierung des Rvi15 Schorfresistenzgens von GMAL 2473, um ein weiteres apfeleigenes Resistenzgen für Transformationen verfügbar zu machen und (3) die Anwendung des apfeleigenen Transkriptionsfaktor-kodierenden Gens MYB10 als potentiellen morphologischen Marker.

Im den ersten beiden Teilen der Arbeit wurden die Apfelsorten 'Brookfield Baigent', 'Mitchgla', 'Novajo' und 'Pinova' durch einen cisgenetischen Ansatz gentechnisch verändert. Dabei wurde das apfeleigene Schorfresistenzgens Rvi6 aus der Wildapfelakzession Malus floribunda No. 821 in diese Sorten übertragen. Durch die Anwendung eines Monitoringvektors konnten im Vorfeld drei neue Methoden zur Aktivierung des hitzeinduzierbaren Flp/FRT Rekombinasesystems etabliert und das System durch Expressionsanalysen molekular genauer charakterisiert werden. Bei den neuen Methoden erfolgte die Hitzebehandlung von Blättern bzw. Blattexplantaten bei 42 °C für 4 h bei 100 % Luftfeuchte (Methode „Feuchtekammer“), auf festem Nährmedium (Methode „Mediumplatte“) bzw. in Flüssigkeitkeit (Methode „ddH2O“/„MSO“).

Zwei cisgene Apfellinien, iM879-68 und iM946-193, wurden erzeugt. Die cisgene Linie iM879-68 der Sorte 'Pinova' wurde mit Methode „Feuchtekammer“ und die cisgene Linie iM946-193 der Sorte 'Brookfield Baigent' mit der Methode „MSO“ generiert. Beide cisgene Linien zeigten einen einzelnen T-DNA-Integrationsort. Das präzise Ausschneiden der Rekombinasekassette aus der im Apfelgenom integrierten T-DNA wurde per Sequenzierung belegt. Beide cisgene Linien besaßen eine verbesserte Schorfresistenz gegenüber dem Venturia inaequalis Isolat 104 (Rasse 1) im Gewächshaus und zeigten ein vergleichbares Rvi6 mRNA-Expressionlevel zu traditionell gezüchteten Rvi6 tragenden Sorten. Die vorliegende Arbeit belegt die erstmalige Produktion cisgener Apfelpflanzen über Anwendung des Flp/FRT Rekombinasesystems.

Im dritten Teil der Arbeit wurde die Präsenz der drei Schorfresistenzkandidatengene Vr2-A, Vr2-B und Vr2-C des Rvi15 Locus in gewählten schorfresistenten und schorfanfälligen Nachkommen einer Kartierungspopulation GMAL2473 × M.×domestica 'Golden Delicious' durch einem PCR-basierten Ansatz untersucht. Fünf analysierte Sämlinge der Kartierungspopulation zeigten eine Rekombination innerhalb des Rvi15 Locus. Da in allen begutachteten schorfresistenten und schorfanfälligen Nachkommen die drei Schorfresistenzkandidatengene anwesend bzw. abwesend waren, konnte keines der drei Kandidatengene als Schorfresistenz vermittelndes Gen identifiziert werden.

Der vierte Teil der Arbeit fokussierte das apfeleigene MYB10 Gen, von dem ein natürliches Allel (MYB10 (R6)) eine sichtbare Anthocyananreicherung in allen Geweben des Apfels verursacht. Das MYB10 (R6) Allel weist eine Insertion im Promotor des MYB10 Gens auf, ursächlich für die Autoinduktion der MYB10 Genexpression. Das Vorkommen des MYB10 (R6) Allels wurde in genetischen Ressourcen des Apfels artübergreifend untersucht. Diese molekularen Daten wurden mit phänotypischen Daten zur Fruchtfleischfarbe und roter Pigmentierung abgeglichen. Für eine Vielzahl von Akzessionen und Sorten wurde ein definierter Abschnitt des MYB10 Promotors sequenziert und offenbarte drei verschiedene MYB10 Promotorhaupttypen: das am häufigsten vorkommende MYB10 (R1) Allel, das MYB10 (R6) Allel und das bisher unbekannte ~1 kb MYB10 Allel. Alle rotfleischigen Akzessionen der Malus Sammlung der Obstgenbank Dresden besaßen das MYB10 (R6) Promotorallel und sind Apfelarten zugeordnet, die ursprünglich in Asien beheimatet waren. Ein Regenerationsversuch mit MYB10 (R6) transgenen Apfellinien zeigte eine eingeschränkte Verwendbarkeit des MYB10 (R6) Allels als morphologischen Marker für die Sorte 'Pinova'.