Biologische Kontrolle der durch <em>Ralstonia solanacearum</em> verursachten Schleimkrankheit: Einblicke in die Ökologie von Antagonisten und deren komplexe Interaktion mit dem Pathogen und dem Rhizosphären-Mikrobiom der Wirtspflanze

Autor/innen

  • Tarek Sayed Ragab Elsayed Institut für Epidemiologie und Pathogendiagnostik

DOI:

https://doi.org/10.5073/dissjki.2016.007

Abstract

Weltweit führen Pflanzenkrankheiten zu starken Beeinträchtigungen der landwirtschaftlichen Produktion, besonders wenn deren Verursacher als Quarantäne-Erreger eingestuft sind. Eine der verheerendsten Krankheiten bei Kartoffel und Tomate, die Schleimkrankheit, wird durch Ralstonia solanacearum (Rs) hervorgerufen, ein epidemisches, bodenbürtiges Quarantäne-Pathogen. Die Persistenz und das jahrelange Überleben von Rs im Boden sowie seine Fähigkeit, eine große Zahl von Wirts- und Nicht-Wirtskulturpflanzen zu besiedeln, ist eine enorme Bedrohung für die Landwirtschaft. Zur Kontrolle des Pathogens sind Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität und zum Suppressionspotential im Boden und in der Rhizosphäre möglicher Wirtspflanzen unerlässlich. In diesem Zusammenhang wurden in dieser Promotionsarbeit die Auswirkungen der Bodenarten (DS, diluvial sand; LL, loess loam; und AL, alluvial loam) und der Kartoffelpflanzensphären (Rhizosphäre, Endorhiza, Endocaulosphäre; Ecto- und Endosphäre der Knolle) auf den Anteil und die Diversität von in vitro-Antagonisten gegen Rs untersucht. Zu diesem Zweck wurden Kartoffelpflanzen unter Feldbedingungen in drei Bodenarten angebaut, die in einer einzigartigen Versuchsfeldanlage seit mehr als 10 Jahren gelagert werden und damit die gleichen Wetterbedingungen und die gleiche Fruchtfolge hatten. Die Untersuchung einer identischen Anzahl dominanter, zufällig gepickter Kolonien aus jeder der Sphären auf in vitro antagonistische Aktivität gegen Rs hat ergeben, dass in allen Sphären Antagonisten unter den dominanten kultivierbaren Bakterien identifiziert werden konnten mit dem höchsten Anteil an Antagonisten in den endophytischen Bereichen. Die molekulare Charakterisierung der Antagonisten ergab, dass mehrere BOX-Genotypen lediglich in einer Bodenart, andere Genotypen hingegen aus zwei bis drei Böden isoliert werden konnten. Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass sowohl die Pflanzensphäre als auch die Bodenart die Diversität und den Anteil von Bakterien mit in vitro antagonistischer Aktivität gegenüber Rs beeinflussen. Eine größere Anzahl von Antagonisten mit für die Pflanze nützlichen Eigenschaften wurde aus Pflanzen isoliert, die in DS-Böden gewachsen waren. Um tiefere Einblicke in die Auswirkungen der drei Bodenarten auf die mit den verschiedenen Pflanzensphären assoziierten Bakteriengemeinschaften zu bekommen, wurden 16S rRNAGenfragmente, die aus der ‚total community‘ DNA (TC-DNA) mittels PCR amplifiziert wurden, mit Hilfe der denaturierenden Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) analysiert. Dadurch konnten die DGGE-Fingerprints der Bakteriengemeinschaften, die mit den fünf Sphären der Kartoffelpflanzen aus den drei Böden assoziiert waren, verglichen werden. Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass die - basierend auf der Bodenart - mit den Kartoffelpflanzensphären assoziierten bakteriellen Gemeinschaften sich in der Rhizosphäre und in dem den Knollen anhaftenden Boden deutlich unterschieden, wohingegen die Fingerprints der endophytischen Bakteriengemeinschaften durch deren niedrige Abundanz variabler waren und weniger von der Bodenart beeinflusst wurden. Zusätzlich gab es deutliche Unterschiede in der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften zwischen den verschiedenen Kartoffelsphären derjenigen Pflanzen, die in der gleichen Bodenart angebaut worden waren, was auf eine nischenspezifische Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften hinweist. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Effekt der Pflanzensphäre deutlich ausgeprägter war als die Auswirkungen des Bodens. Die meisten Antagonisten aus unserer ersten Studie (Kap. 2) gehörten zur Gattung Pseudomonas, die in der Rhizosphäre oft verstärkt auftritt aufgrund ihrer Fähigkeiten, schnell auf Wurzelexsudate zu reagieren, über eine gute Rhizosphärenkompetenz zu verfügen und verschiedene Stoffe mit nützlicher Aktivität für die Pflanze zu produzieren. Wir untersuchten den Einfluss der drei Bodenarten auf die Vielfalt der Pseudomonas-Populationen und Gene mit Bezug auf vorteilhafte Eigenschaften in den verschiedenen Kartoffelpflanzensphären. Die Zusammensetzung der mit diesen Sphären assoziierten Pseudomonas-Gemeinschaften wurde mittels DGGE-Fingerprints von Pseudomonas-spezifischen, aus TC-DNA amplifizierten 16S rRNA-Genfragmenten und mittels Pseudomonas-spezifischer real-time PCR analysiert, um zu bestimmen, inwiefern diese von den Bodenarten und/oder Kartoffelpflanzensphären beeinflusst werden. Die PCR-Southern blot-Hybridisierung wurde ingesetzt, um die Häufigkeit und Verteilung von Pseudomonas-spezifischen Genen (phl, phz, prnD, hcnBC, pcbC, pqqE und gacA) zu erforschen, deren Genprodukte möglicherweise für die biologische Kontrolle und die Förderung des Pflanzenwachstums in verschiedenen Pflanzensphären und Bodenarten bedeutsam sind. Die Diversität der Pseudomonas-Gemeinschaft wurde durch die Bodenart wesentlich beeinflusst. Ein Effekt der Bodenart wurde jedoch nur im nichtdurchwurzelten Boden und in dem Boden, der fest an den Ernteknollen haftete, beobachtet. Sowohl Bodenart als auch Pflanzensphäre bestimmten die Verteilung der funktionellen Gene von Pseudomonas. Mittels Southern blot- Hybridisierung konnte gezeigt werden, dass die höchste Vielfalt und Abundanz aller getesteten Gene in der Rhizosphäre von in den LL-Böden gewachsenen Kartoffelpflanzen zu finden war (mit Ausnahme von 2,4-Diacetylphloroglucinol [phl]). Unsere Studie hat gezeigt, dass sowohl die Zusammensetzung der Pseudomonas-Populationen als auch die Abundanz und Diversität ihrer funktionellen Gene in der Rhizospäre von der Bodenart beeinflusst wurden und dass Pseudomonas-Populationen, die die untersuchten Gene korreliert mit der Bodenart und der Anreicherung dieser Gene trugen, vom bodenartbedingten Rhizosphären-Effekt abhängig waren. Abschließend wurden drei Gewächshaus-Experimente mit Tomatenpflanzen durchgeführt, um die Rhizosphären-Kompetenz von in vitro-Antagonisten und ihre Fähigkeit der Kontrolle von Rs unter Gewächshausbedingungen zu testen. Die Keimzahl von Rs und der Antagonisten wurde durch selektive Plattierung bestimmt. Zusätzlich wurde die Rs-spezifische Kopienzahl mit Hilfe von real-time PCR und PCR-Southern blot-Hybridisierung des fliC-Gens kultivierungsunabhängig ermittelt. Die mit den potentiellen Antagonisten Bacillus vallismortis (B63) und Pseudomonas brassicacearum (AL2YTEN-142) inokulierten Pflanzen zeigten keine oder eine klare Verzögerung der durch Rs hervorgerufenen Krankheitssymptome, und ihre Rs- Population nahm im Vergleich zu den nicht inokulierten Pflanzen ab. Amplikon-Sequenzierung von 16S rRNA-Genfragmenten, die aus TC-DNA amplifiziert wurden, zeigte deutliche, von der Behandlung abhängige Verschiebungen in den Bakteriengemeinschaften der Tomaten-Rhizosphäre. Von größter Bedeutung ist, dass der starke Rückgang von Rs in Gegenwart der Antagonisten im Gewächshausversuch bestätigt werden konnte und dass dynamische Taxa als Reaktion auf Rs oder die inokulierten Antagonisten bestimmt wurden. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wurden Kolonisierungsmuster von AL2YTEN-142 ermittelt werden. Gfp-positive Zellen wurden in Lateralwurzeln, Wurzelhaaren und Epidermiszellen sowie innerhalb von Xylemgefäßen nachgewiesen. Beide Biokontrollstämme (B63 und AL2YTEN-142) sind somit im Hinblick auf die Kontrolle von Rs unter Feldbedingungen sehr vielversprechend. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese Promotionsarbeit einen tieferen Einblick in die Auswirkungen von unterschiedlichen Bodenarten und der Mikro-Umgebung von Pflanzen auf die Gesamt- und Pseudomonas-Gemeinschaften gewährt, wobei der Diversität von Rs-Antagonisten hier besondere Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Eine Auswahl von Antagonisten wurde unter Gewächshausbedingungen an Tomaten bezüglich ihrer Fähigkeit zur biologischen Kontrolle von Rs getestet, und die komplexen Wechselwirkungen zwischen Antagonisten, Pathogen und indigenem Mikrobiom der Rhizosphäre wurden mit Hilfe der Amplikon- Sequenzierung bestimmt. In zukünftigen Untersuchungen soll die Biokontrolle von Rs und die Pflanzenwachstumsförderung an Kartoffeln unter Feldbedingungen in Ägypten getestet werden.

Auf Wunsch des Autors / der Autorin ist diese Dissertation nur als Druckausgabe verfügbar.

Veröffentlicht

2018-07-20

Ausgabe

Rubrik

Dissertation