Studien zum Resistenzlokus Rpv10 gegen den Falschen Mehltau (Plasmopara viticola) der Weinrebe (Vitis vinifera)

Abstract

Durch die verschiedenen Analysen in diesem Projekt, kann der Rpv10-Lokus besser verstanden werden. Durch die Auswahl differenter Genotypen mit verschiedenen Resistenzloki (Rpv3.3, Rpv10, Rpv10/3.3) konnte eine Reaktion auf das Pathogen spezifiziert werden. Durch diverse Färbemethoden und Mikroskopiertechniken konnte gezeigt werden, dass Träger des Rpv10-Lokus eine ähnlich starke HR wie Rpv3.3-Träger zeigen und diese verstärkt wird, wenn beide Resistenzloki kombiniert in einem Genotypen vorkommen. Die Infiltration des Pathogenmyzels im Mesophyll konnte durch die Anilin-Blau-Färbung mikroskopisch sichtbar gemacht und anschließend an verschiedenen Tagen (2 dpi, 7 dpi) graphisch durch die Software WinRhizo quantifiziert werden. Dabei bilden die Genotypen mit gleichen Resistenzloki eine Gruppe. In einer RNA-Seq-Studie mit verschiedenen Genotypen (Rpv10 homozygot, Rpv10/Rpv3 heterozygot, anfällig) konnten eine Vielzahl induzierter Gene der frühen Abwehr gegen P. viticola analysiert und in unterschiedliche GO-Terme funktionell eingeteilt werden. Dabei bilden die „biologischen Prozesse“ die größte Untergruppe. In dieser wurden weitere Gruppen spezifiziert. Weiterhin konnten verschiedene induzierte Transkriptionsfaktoren gefunden werden, wovon im weiteren Verlauf stichpunktartig zwei über qRT-PCR getestet wurden. Durch die RNA-Seq-Studie konnten auf Chromosom 16 zwei Gen-Cluster beschrieben werden, die für den Abwehrprozess eine entscheidende Rolle spielen. Das PAL-Cluster nimmt dabei die erste Position innerhalb der Abwehr ein und aktiviert dabei das nachgeordnete zweite Cluster von Sekundärmetaboliten. Dieses STS-Cluster enthält zahlreiche STS-Gene, die bei einer Induktion zum Eindämmen oder Absterben des Pathogens führen. Dabei zeigte sich die größte Anzahl an hochregulierten Genen im heterozygoten Genotypen und die geringste Anzahl erwartungsgemäß im anfälligen. Durch eine Stilben-Analyse mittels HPLC konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Es wurde zu vier verschiedenen Zeitpunkten (vor der Inokulation, 24 hpi, 48 hpi, 72 hpi) der Gehalt von sieben Substanzen gemessen. In den resistenten Genotypen zeigte sich innerhalb der drei pathogentoxisch wirkenden Substanzen (trans-Resveratrol, trans--Viniferin, trans--Viniferin) ein stetiger Anstieg der Konzentrationen. Dabei wurden die höchsten Konzentrationen bei ’Solaris’ detektiert. Diese eckt sich mit den Resultaten der RNA-Seq-Studie. Für die spätere Abwehr konnten zwei Kandidatengene aus dem Rpv10-Lokus identifiziert werden. Dabei handelt es sich um Rpv10#1 und Rpv10#2. Das Homolog zu Rpv10#1 ist ein Resistenzgen aus A. thaliana und kann den NBS-LRR-Genen zugeordnet werden. Bei dem Homolog von Rpv10#2 handelt es sich um den TF AP2/ERF, ebenfalls in A. thaliana charakterisiert. Beide Kandidatengene wurden mit verschiedenen bioinformatischen Analysen näher untersucht. Die Gene konnten im weiteren Verlauf amplifiziert, kloniert und in anfällige Reben transformiert werden. Die Funktion dieser Gene konnte in transgenen Pflanzen auf Grund langer Regenerationszeiten noch nicht analysiert werden. Es zeigt sich aus den Studien, dass der Rpv10-Lokus einen starken Abwehreinfluss ausübt. Dieser wird durch das Vorhandensein anderer Resistenzloki verstärkt. Der Mechanismus kann durch das Zusammenspiel von verschiedenen aufeinanderfolgenden Einzelreaktionen beschrieben werden. Wobei die ersten eintretenden Reaktionen auf den Pathogenkontakt durch Superoxide ausgelöst werden, die sich zu einer HR aufbauen. Weiterhin werden im ersten Stadium pathogentoxische Substanzen ausgeschüttet, die das Wachstum des Pathogens hemmen. Es handelt sich in diesem Fall nicht um eine Immunität bei der das Pathogen direkt nach der Penetration abgetötet, sondern langfristig inhibiert wird. Denn wie beobachtet werden konnte, verhalten sich die untersuchten Genotypen bis nach dem ersten Tag gleich. Die Zoosporen finden die Stomata, bilden eine Penetrationshyphe und beginnen mit der Infiltration des Mesophylls. Nach 24 hpi verändern sich jedoch diese Beobachtungen und die Genotypen zeigen ein unterschiedliches Verhalten auf das Pathogenwachstum. Im zweiten Stadium der Pathogenabwehr zeigt eines oder mehrere Gene aus dem Rpv10-Lokus den stärksten Einfluss auf den Abwehrprozess, denn wie bei den Rpv3.3 tragenden Gentypen gezeigt werden konnte, bilden diese nach sieben Tagen ebenfalls Sporangien. Keiner der Rpv10 tragenden Genotypen bildete während der Versuche Sporangien.