Mapping and characterization of resistance to downy mildew in an East Asian grapevine genetic resources

Abstract

Der Falsche Mehltau der Rebe, der durch den obligat biotrophen Oomyceten Plasmopara viticola verursacht wird, gehört zu den gefährlichsten Erkrankungen der Rebe, da er zu erheblichen Ertragsverlusten führen kann. Der regelmäßige Einsatz von Fungiziden ist notwendig, um Ertragseinbußen zu verhindern, führt aber zu nachteiligen Umweltauswirkungen und geht einher mit einer geringen gesellschaftlichen Akzeptanz. Resistente Rebsorten können eine Ergänzung zu den herkömmlichen Strategien in der Bekämpfung des Falschen Mehltaus darstellen und zu einem nachhaltigen und umweltfreundlichen Weinbau beitragen, indem durch ihre Nutzung die Ausbringung von Pflanzenschutzmitteln drastisch reduziert werden kann. Daher ist es naheliegend, dass die Rebenzüchtung den Fokus auf pilzresistente Sorten legt und dabei natürlich vorkommende Resistenzen von Wildarten der Rebe nutzt. Die primären Zuchtziele sind daher die Identifizierung neuer Resistenzen mit unterschiedlichen Abwehrmechanismen, um einen Krankheitsausbruch und resistenzbrechende Isolate zu verhindern. Bis heute wurden mehr als 30 Resistenzloci gegen P. viticola identifiziert.

In dieser Studie wurde die bi-parentale F1-Population ('Morio Muskat' x COxGT2 (V. coignetiae x 'Gewürztraminer')) Gf.2018-063 untersucht, um Resistenzen gegen P. viticola zu identifizieren und zu kartieren. Als Resistenzquelle diente die bisher ungenutzte ostasiatische Wildart Vitis coignetiae. Es wurde eine genetische Karte basierend auf 109 simple sequence repeats (SSR)-Markern erstellt sowie eine weitere genetische Karte mit 647 Markern auf Grundlage der RNase-H2-abhängigen Amplikon-Sequenzierung (rhAmpSeq). Die daraus resultierende hochauflösende rhAmpSeq-Karte umfasst eine Gesamtlänge von 1147,36 cM, mit 19 Kopplungsgruppen und einem durchschnittlichen Abstand zwischen den Loci von 3,2 cM. Die phänotypischen Daten (Blattscheiben-Test) wurden über drei Jahre erhoben und in Quantitative Trait Locus (QTL)-Analysen unter Verwendung jeder einzelnen Kopplungskarte eingesetzt. Es konnte ein konsistenter und hoch signifikanter QTL auf Chromosom 14, mit einer erklärten phänotypischen Varianz von bis zu 36,4 % ermittelt werden. Dieser QTL teilt keine SSR-Markerallele mit den bereits existierenden, von V. amurensis abgeleiteten, QTLs Rpv8 und Rpv12 auf Chr. 14. Daher wurde er als Rpv32 (Resistenz Plasmopara viticola 32) bezeichnet (Malagol et al., 2023, in Vorbereitung). SSR- und rhAmpSeq-Marker, die in dieser Forschungsarbeit identifiziert wurden, können in der markergestützten Selektion für die Introgression von Rpv32 in Zuchtlinien und die Pyramidisierung von Resistenzen genutzt werden. Darüber hinaus zeigen und bestätigen mikroskopische Färbungsstudien in verschiedenen Zeitintervallen und quantitative Analysen von P. viticola (5 dpi), dass der resistente parentale Genotyp (COxGT2) im Gegensatz zum anfälligen Genotyp ('Morio Muskat') die Vermehrung des Pathogens verhindert. Weiterhin zeigt die in dieser Studie verwendete Population eine Segregation für das morphologische Merkmal Blattbehaarung, für das ein signifikanter QTL auf Chr. 5 mit einer erklärten Varianz von 24 % (ribbon trichome) identifiziert wurde. Die Hypothese, dass die Blattbehaarung als physische Barriere gegen P. viticola dient, wurde in allen Jahren analysiert. Jedoch wurde kein Zusammenhang zwischen der Dichte der Blatthaare und dem Befall der Blattscheiben mit P. viticola im vorliegenden Fall festgestellt.

Herkömmliche Methoden der Phänotypisierung sind sowohl zeit- und arbeitsintensiv, als auch subjektiv, wenn unterschiedliche Personen solche Daten erheben. Diese Subjektivität kann zu statistischem Rauschen und zu Verzerrungen im Ergebnis führen. Daher konzentrierte sich die vorliegende Forschungsarbeit zusätzlich auf das Training und die Entwicklung eines auf künstlicher Intelligenz (SCNN: Shallow convolutional neural network) basierenden Hochdurchsatzmodells zur Quantifizierung der Resistenzeigenschaften gegen den Erreger des Falschen Mehltaus (Zendler et al., 2021). Das Modell erreicht eine Gesamtvorhersagegenauigkeit von 97 %. Die Leistung des SCNN-Modells wurde durch eine hohe und signifikante Korrelation mit den Daten von unabhängig bewertenden Experten nachgewiesen. Dieses SCNN-Modell, in Kombination mit einem automatisierten Bildgebungssystem, bietet eine hohe Genauigkeit und verringert den Zeitaufwand für die Phänotypisierung. Die Pipeline ist daher ein wertvolles Instrument für die Forschung in der Rebenzüchtung.

Als zusätzlicher Aspekt dieser Arbeiten wurde ein auf Convolutional Neural Network (ResNet-CNN) basierendes Analysemodell für die Quantifizierung von Blatthaaren entwickelt, da bisher keine genauen und präzisen Werkzeuge zu deren Phänotypisierung zur Verfügung standen (Malagol et al., 2023, in Vorbereitung). Die Gesamtvorhersagegenauigkeit des Modells beträgt 95,41 %. Die Validierung und die Kreuzvalidierung mit zwei Experten und zwei Nicht-Experten zeigten eine außergewöhnliche Korrelation (R = 0,98 und R = 0,92, RMSE 8,20 bzw. 14,18). Die berechneten absoluten Fehler weisen eindeutig auf eine durch die Subjektivität bedingte Verzerrung hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das entwickelte ResNet-CNN in der Lage ist, die objektive Phänotypisierungsgenauigkeit für das Merkmal „Dichte der Blatthaare“ zu verbessern und eine präzisere Analyse des Merkmals zu ermöglichen (Annex III & Annex IV). Damit steht ein neues Werkzeug zur Verfügung, das die Voraussetzungen für die genetische Analyse der Dichte der Blattbehaarung als physische Barriere gegen P. viticola schafft.