Etablierung einer Flp/<em>FRT</em>-vermittelten Rekombination des Selektionsmarkers und Untersuchungen zur RNAi-induzierten Resistenzerhöhung gegenüber pilzlichen Schaderregern beim Apfel (<em>Malus x domestica</em> BORKH.)

Autor/innen

  • Katja Herzog Institut für Züchtungsforschung an gartenbaulichen Kulturen und Obst

Abstract

Eines der wichtigsten Ziele gentechnologischer Arbeiten ist die Erzeugung transgener Kulturpflanzen ohne die Verwendung von Selektionsmarkergenen. Die Selektion transgener Zellen erfolgt beim Apfel (Malus x domestica BORKH.) in der Regel im Anschluss an einen Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Gentransfer mit dem nptII/Kanamycin-System. Im Oktober 2002 wurde eine neue EU-Freisetzungsrichtlinie (2001/18/EG) rechtskräftig. Im Rahmen dieser Richtlinie ist vorgesehen, dass die Verwendung von Markergenen, insbesondere von Antibiotikaresistenzgenen, eingeschränkt werden soll. Das bedeutet, dass die Freisetzung gentechnisch modifizierter Organismen, welche beispielsweise das nptII-Gen als Selektionsmarker enthalten, unzulässig ist. Aus diesem Grund ist die Etablierung alternativer Selektionsstrategien zwingend notwendig. Aktuell ist jedoch noch kein vergleichbares Selektionsystem zur Ablösung des nptII/Kanamycin-Systems beim Apfel verfügbar. Deshalb wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Funktionsfähigkeit und Anwendbarkeit des Flp/FRT-Rekombinationssystems zur nachträglichen Entfernung des nptII-Gens an Apfel untersucht. Ziel dabei war die Erzeugung gentechnisch modifizierter Apfelsprosse, die keinen Selektionsmarker mehr enthalten. Für die Untersuchungen wurde ein Monitoringvektor erstellt und in den Agrobakteriumstamm GV3101-pMP90RK übertragen. Mit diesem Stamm wurden in 17  Transformationsexperimenten insgesamt 4.080 in-vitro-Apfelblätter inokuliert und neun transgene Linien aufgebaut. Der transformierte Vektor enthält auf der funktionellen T-DNA einen CaMV 35S-Promotor und ein gusA-Reportergen. Dazwischen liegt ein sogenanntes FRT-flankiertes Fragment, welches das gusA-Gen räumlich vom CaMV 35S-Promotor trennt. Dieses FRT-flankierte Fragment besteht aus dem nptII-Markergen und dem flp-Rekombinase-Gen, welches von dem Hitzestress-induzierbaren Promotor Gmhsp17.5E aus der Sojabohne Glycine max reguliert wurde. Eine Expression von gusA wurde somit erst nach der Entfernung des FRT-flankierten Fragments erwartet. Dies ermöglichte eine schnelle Detektion von Rekombinationsereignissen mittels histologischen GUS-Tests. Die Linie T670 war die erste transgene Apfellinie, die selektiert und vermehrt werden konnte. Mit den Sprossspitzenkulturen dieser Linie wurden verschiedene Zeit- und Temperaturregime zur Induktion des Gmhsp17.5E-Promtors durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass eine Behandlung transgener Apfelsprosse bei 42°C Flp-vermittelte Rekombinationen bewirkte. Die Hitzestress-induzierte Rekombination erfolgte jedoch nicht in allen Zellen gleichzeitig, denn es wurden überwiegend Sprosse mit Mischgeweben detektiert. Um vollständig nptII-freie, transgene  Apfelsprosse zu erzeugen, wurden die Blätter der Linien T670, T781, T782 und T793 nach einer Hitzestress-Behandlung geerntet und die Blattstreifen für 16 Wochen auf Regenerationsmedium ohne selektierendes Kanamycin aufgelegt. Für die Detektion putativ nptII-freier Sprosse wurden im Anschluss an die Regeneration stichprobenartig jeweils bis zu 40 Sprossregenerate ausgewählt und mittels GUS-Test analysiert. Auf diese Weise konnten bis zu 38 Prozent GUS-positive, putativ nptII-freie Sprossregenerate identifiziert werden. Die molekularen Untersuchungen an genomischer DNA und mRNA verschiedener Sprossregenerate der Linien T781 und T782 haben gezeigt, dass die Regeneration Hitzestress-behandelter Blätter vollständig nptII-freie Apfelsprosse erzeugte. Um das Flp/FRT-Rekombinationssystem praxisorientiert zu verbessern, wurde ein weiterer Monitoringvektor konstruiert, welcher ein zusätzliches Selektionssystem enthält. Mit diesem zweiten Selektionssystem könnten nptII-freie Sprossregenerate gezielt selektiert und der Vektor später zur Übertragung gewünschter Zielgene eingesetzt werden. Auf diese Weise ist es zukünftig möglich, gentechnologisch modifizierte Apfelpflanzen zu erzeugen, die langfristig keine Antibiotikaresistenzgene mehr tragen. Ein weiteres grundlegendes Ziel gentechnologischer Arbeiten in der Apfelzüchtung besteht in der Erhöhung der Resistenz gegenüber biotischen Schaderregern. Im Mittelpunkt des Interesses steht besonders die Verbesserung der Resistenz gegenüber phytopathogenen Pilzen, wie dem Apfelmehltau Podosphaera leucotricha und dem Apfelschorf Venturia inaequalis. Für verschiedene apfeleigene Resistenzquellen existieren zwar molekulare Marker, die Sequenzen beteiligter Resistenzgene sind bisher jedoch kaum identifiziert. Aus diesem Grund ist die Verwendung arteigener Resistenzgene für  gentechnologische Ansätze bislang kaum möglich. Eine Erfolg versprechende Methode stellte deshalb die RNAi-basierte Stilllegung von Genen des Krankheitserregers dar. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Experimente mit Apfel durchgeführt, die eine wirtinduzierte Abwehrstrategie gegenüber den pilzlichen Schaderregern untersuchten. Als erstes wurde der Transport synthetischer, Fluoreszein-markierter siRNA-Moleküle aus pflanzlichen Blättern in die Hyphen von P. leucotricha gezeigt. Die Behandlung des Pilzes mit einem Atmungsblocker hat zusätzlich verdeutlicht, dass die Aufnahme pflanzlicher siRNAs in pilzliche Infektionsstrukturen wahrscheinlich ein ATP-abhängiger Prozess ist. Der effiziente Einsatz eines RNAi-induzierten Resistenzmechanismus an Apfelpflanzen setzt die Stilllegung eines essentiellen Pilzgens voraus. Hierfür wurde das Chitinsynthase Klasse V-Gen als potentielles Target ausgewählt und mit der Isolierung des Gens aus P. leucotricha und V. inaequalis begonnen. Die Expression dieses Gens ist für die Zellwandstabilität und die pilzliche Entwicklung essentiell (WERNER et al. 2007), weshalb die Stilllegung eines solchen Genes die Krankheitsentwicklung des Apfelmehltaus bzw. Apfelschorfs an transgenen Apfelblättern verlangsamen oder sogar hemmen könnte.

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Veröffentlicht

2012-03-26

Ausgabe

Rubrik

Dissertation