SPO11 dependent initiation of meiotic double strand breaks in <em>Arabidopsis thaliana</em>

Abstract

Der Austausch und die Reorganisation von genetischem Material zwischen zwei Individuen ist eine
essentielle Funktion der Meiose. Selbst wenn in den letzten Jahren bedeutsame Erkenntnisse über
die Meiose, insbesondere bei Pflanzen, erzielt werden konnten, bleiben einige Schlüsselfragen
ungeklärt. Für ein besseres Verständnis der Meiose ist es wichtig, zu entschlüsseln, warum Pflanzen
zwei sehr verschiedene meiotisch aktive SPO11 Proteine benötigen. Dies steht im Gegensatz zu
vielzelligen Tieren und Pilzen, die nur ein SPO11 besitzen und bei denen dieses für die korrekte
Meiose ausreichend ist. In Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) werden zwei SPO11 Proteine
benötigt, Ath SPO11-1 und Ath SPO11-2 genannt, um während der Prophase I Doppelstrangbrüche
(DSB) zu induzieren. In nahezu allen Eukaryoten sichern DSB auf der einen Seite die Genomstabilität
durch eine korrekte Paarung und Verteilung der Chromosomen und auf der anderen Seite die
genetische Vielfalt, da sie die Rekombination erst ermöglichen. Ohne DSB gibt es keine Verbindung zwischen homologen Chromosomen und Rekombination, Paarung und chromosomale Überkreuzungen sind daher ausgeschlossen. Dies führt zu einer zufälligen Chromosomenverteilung sowie beinahe vollständiger Sterilität. Deswegen wurden in dieser Arbeit die Evolution, die speziellen Funktionen und ein mögliches Zusammenspiel der beiden verschiedenen SPO11 Proteine in Pflanzen untersucht. Hierfür wurde eine Datenbanksuche durchgeführt und es konnten SPO11 Homologe in nahezu allen biologischen Reichen identifiziert und analysiert werden. Um die speziellen Funktionen der beiden SPO11 Paraloge in A. thaliana zu untersuchen, wurden drei nicht konservierte Bereiche sowie das konservierte letzte Exon zwischen beiden SPO11 ausgetauscht. Zusätzlich wurden beide um das letzte Exon verkürzt. Durch diese Änderungen konnte eine Sequenz spezifische Funktion beider SPO11 Proteine aufgedeckt werden. Durch den Austausch von SPO11-1 und -2 aus A. thaliana mit verwandten und mehr urtümlichen SPO11 Orthologen konnte zusätzlich eine Speziesspezifität für das jeweilige SPO11 gezeigt werden. Eine Komplementation war nur mit dem nahe verwandten SPO11 aus Brassica rapa möglich. Eine Teilkomplementation konnte erreicht werden, indem SPO11-1 cDNA aus Papaya (Carica papaya) mehrfach integriert wurde. Während der Analysen wurde eine erhebliche Anzahl aberranter Formen von gespleißten SPO11-1 und -2 in verschiedenen Pflanzen identifiziert. Die Analyse des Spleißens von SPO11, sowohl in der Ursprungspflanze als auch nach der Transformation in A. thaliana konnte eine Spezies und Sequenzspezifität nachweisen. Zusätzlich zeigte das Spleißmuster der chimären SPO11 eine Sequenzabhängigkeit der einzelnen Spleißeffekte. Zusammengefasst sind die Funktionen und das konservierte Spleißen von meiotischen SPO11 sequenzspezifisch und die jeweiligen SPO11 Orthologe sind speziesspezifisch. Um ein mögliches Zusammenspiel der beiden SPO11 während der Meiose zu zeigen wurde ein Antikörper gegen SPO11-2 entwickelt. Erste Ergebnisse zeigen eine Kolokalisation beider SPO11 während der frühen Prophase. SPO11-2 scheint jedoch länger an den Chromatiden zu verweilen.