Quantitative detection of <em>Potato virus Y</em> and <em>Potato leaf roll virus</em> by real time PCR – a molecular approach with numerous applications in potato research

Abstract

Virusresistenzforschung an der Kartoffel hat hohe Priorität. In Kartoffelanbauregionen Afrikas ist die Mehrzahl der auf regionalen Märkten angebotenen Knollen mit Kartoffelviren, wie Potato virus Y (PVY) und/oder Potato leaf roll virus (PLRV) infiziert, was regelmäßig zu katastrophalen Ernteausfällen führt. Im Gegensatz dazu spielen Viruskrankheiten der Kartoffel aufgrund effizienter Saatgutzertifizierungssysteme in Industrienationen kaum eine Rolle. Nichtsdestotrotz zählen PVY und PLRV aufgrund des hohen potentiellen Ertragsverlustes weltweit zu den bedeutendsten Pathogenen der Kartoffel. Wegen ihrer hohen Replikationsrate entwickeln sich Viren sehr schnell und könnten bestehende Resistenzen überwinden. In jüngster Zeit wurden die gewöhnlichen PVY-Stämme immer mehr durch rekombinante Stämme, wie PVY^N-Wi oder PVY^N:O und PVY^NTN verdrängt. Diese sind höchst virulent und sind Verursacher von Ringnekrosen an Kartoffelknollen (potato tuber necrotic ringspot disease: PTNRD). Diese Herausforderungen in der Kartoffelforschung und im Kartoffelanbau erfordern erweiterte Kenntnisse über die Epidemiologie von PVY- und PLRV-Stämmen. Zudem müssen sich Züchtungsprogramme der Kartoffel auf die Einführung neuer Resistenzgene und der Generierung von Genotypen konzentrieren, die an die klimatischen Bedingungen ihrer Anbauregion angepasst sind. Zuverlässige und sensitive Methoden zur Virusdetektion können bei der Lösung der genannten Herausforderungen helfen. In dieser Arbeit werden die Entwicklung und Anwendung von reverse transcription real-time PCR (RT-qPCR)-Detektionsverfahren vorgestellt, die die weltweit bedeutendsten Kartoffelviren PVY und PLRV quantifizieren und damit einen wichtigen Beitrag auf verschiedenen Gebieten der Kartoffelforschung leisten können. Es wird dargestellt, dass das entwickelte RT-qPCR-Detektionsverfahren für die Quantifizierung von PVY hoch sensitiv ist und für die direkte Testung sogar frisch-geernteter Kartoffelknollen während der Saatgutzertifizierung eingesetzt werden kann. Ein ähnlich sensitives Verfahren wurde verwendet, um Solanum-Arten und Nachkommen von somatischen Hybriden auf das Niveau ihrer Resistenz gegen PVY zu bewerten. Die Anreicherung von PVY variierte zwischen den Wildkartoffelarten, die bis dahin einheitlich als extrem resistent eingestuft worden waren. Somit könnte die RT-qPCR ein interessantes Werkzeug für die Resistenz-Evaluierung in Züchtungsprogrammen sein. Eine andere Anwendung der RT-qPCR stellt die Einschätzung der Virulenz verschiedener PLRV-Isolate dar. Ein Zusammenhang zwischen dem PLRV-Titer in Kartoffelpflanzen und der Virulenz der Virusisolate konnte nicht ermittelt werden. Allerdings erlaubt die unterscheidende Quantifizierung verschiedener PLRV RNA-Arten weitere epidemiologische Studien. Abschließend wurde demonstriert, dass die RT-qPCR ein nützliches Werkzeug ist, um die Äquivalenz gentechnisch veränderter Kartoffeln hinsichtlich ihrer PVY-Anfälligkeit zu untersuchen. Eine erhöhte Anfälligkeit für PVY könnte ein verlässlicher Indikator für mögliche ungewollte Effekte sein, die durch die genetische Modifikation verursacht wurden. Es wird gezeigt, dass der Nachweis von Äquivalenz schwierig ist, wenn der nicht-transgene Komparator selbst nicht äquivalent ist und wenn die Einstufung in äquivalent und nicht-äquivalent abhängig von Umweltbedingungen ist.