Methoden zur Untersuchung der Allelfrequenzen und-verteilung im Acetolactat-Synthase (ALS)-Gen bei Target-Site-Resistenzen in <i>Echinochloa crus-galli</i>

Abstract

Hühnerhirse (Echinochloa crus-galli) gewinnt als Ungras im Maisanbau zunehmend an Bedeutung. Einseitiger Einsatz von ALS-Inhibitoren erzeugt einen Selektionsdruck, der zu vermehrtem Auftreten von Resistenzen führt. Häufig handelt es sich um Target-Site-Resistenzen (TSR) mit Punktmutationen an den Positionen Ala-122, Pro-197 oder Trp-574 des ALS-Gens. Dieses liegt in der hexaploiden Hühnerhirse in drei homologen Varianten vor. Gängige PCR-Verfahren ermöglichen nur eine gemeinsame Analyse aller Genvarianten, wodurch ein großer Teil des Informationsgehalts verloren geht. Für eine fundierte Aussage müssen die Genvarianten getrennt analysiert werden. Ein methodischer Ansatz war die allel-spezifische PCR. Hierfür wurden DNA-Polymorphismen zwischen den drei ALS-Genvarianten genutzt, um diese separat bei Position 574 hochspezifisch zu amplifizieren und zu sequenzieren. Die schwierige Struktur und geringe Polymorphismen verhinderten den Einsatz der allel-spezifischen PCR an den Positionen 122 und 197. Hier wurden die drei Genvarianten gemeinsam amplifiziert und anschließend in einem mehrstufigen Ansatz mit Restriktionsenzymen spezifisch verdaut. Nach Separation, Aufreinigung und Reamplifikation der Fragmente wurden die einzelnen Genvarianten durch Pyrosequenzierung analysiert. So konnten an Position Ala-122 in allen ALS-Homologen heterozygote Mutationen nachgewiesen werden, bei Pro-197 und Trp-574 dagegen heterozygote bzw. homozygote Mutationen nur bei ALS3. Durch die Etablierung dieser Methoden können nun Resistenzmuster in Populationen von Echinochloa crus-galli detaillierter untersucht und wichtige Daten zu deren Ausbreitungsdynamik gewonnen werden.