On the discovery of genes involved in metabolism-based resistance to herbicides using RNA-Seq transcriptome analysis in <em>Lolium rigidum</em>

Autor/innen

  • Todd A. Gaines
  • Lothar Lorentz
  • Andrea Figge
  • Frank Maiwald
  • Mark-Christoph Ott
  • Heping Han
  • Roberto Busi
  • Quin Yu
  • Stephen B. Powles
  • Roland Beffa

DOI:

https://doi.org/10.5073/jka.2014.443.007

Abstract

Weed control failures due to herbicide resistance are an increasing and worldwide problem significantly impacting crop yields. Herbicide resistance due to increased herbicide metabolism in weeds is not well characterized at the genetic level. An RNA-Seq transcriptome analysis was used to identify genes conferring metabolism-based herbicide resistance (MBHR) in a population (R) of a major global weed (Lolium rigidum), in which resistance to the herbicide diclofop-methyl was experimentally evolved through recurrent selection from a susceptible (S) progenitor population. A reference transcriptome of 19,623 contigs was assembled using 454 sequencing technology on a cDNA library and annotated using UniProt and Pfam databases. Transcriptomic-level gene expression was measured using Illumina 100 bp reads from untreated control, mock, and diclofop-methyl treatments of R and S. Due to the established importance of cytochrome P450 (CytP450), glutathione-S-transferase (GST), and glucosyltransferase (GT) genes in MBHR, 11 contigs with these annotations and higher constitutive expression in untreated R than in untreated S were selected as candidate genes for hypothesis testing, along with 17 additional differentially expressed contigs with annotations related to metabolism or signal transduction. In a forward genetics validation experiment, higher constitutive expression of nine contigs co-segregated with the resistance phenotype in an F2 population, including 3 CytP450, 3 GST, and 1 GT. At least nine genes with heritable increased constitutive expression are associated with MBHR trait. In a physiological validation experiment where 2, 4-D pre-treatment induced diclofop-methyl protection in S individuals due to increased metabolism, seven of the nine genetically-validated contigs were significantly induced. These data help explain accumulation of resistance-endowing genes and rapid evolution of MBHR, and provide the opportunity to improve diagnostics of MBHR using molecular tools such as transcriptional markers.

Keywords: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), diclofop-methyl, evolution, herbicide metabolism, herbicide resistance, next-generation sequencing, transcriptional markers

Zur Entdeckung der beteiligten Gene an der metabolischen Herbizidresistenz in Lolium rigidum durch RNA-Seq Transkriptom Analyse.

Zusammenfassung

Herbizidresistenz ist weltweit ein zunehmendes Problem in der Landwirtschaft, vor allem der enzymatische Abbau von Wirkstoffen bzw. die metabolische Herbizidresistenz (MBHR) ist bislang noch weitgehend unbekannt, besonders auf genetischer Ebene. Um die an einer MBHR beteiligten Gene zu identifizieren wurde das Transkriptom von Herbizid-resistenten und sensitiven Weidelgräsern (Lolium rigidum) in einem RNA-Seq-Ansatz verglichen. Die verwendete Diclofop-Methyl herbizidresistente Population wurde experimentell aus einer sensitiven Population rekurrent selektiert. Ein 19623 Contig umfassendes Referenztranskriptom wurde aus einer cDNA Bibliothek der resistenten Pflanzen durch 454 Sequenzierung erstellt und mit Hilfe von UniProt und Pfam annotiert. Mit 100 bp Illumina-Reads wurde die Genexpression in unbehandelten, mit Blindformulierung und mit formuliertem Herbizid Diclofop-methyl behandelten resistenten und sensitiven Pflanzen untersucht. Es ist bekannt, dass Cytochrom P450 (CytP450), Glutathion-S-transferasen (GST) oder Glycosyltransferasen (GT) eine wichtige Rolle in der MBHR spielen. Elf Contigs, die als solche annotiert und in unbehandelten resistenten Pflanzen konstitutiv höher exprimiert sind als in Sensitiven, wurden als Kandidatengene ausgewählt und getestet. Zusätzlich wurden 17 weitere Contigs untersucht, die zwischen resistenten und sensitiven Pflanzen unterschiedlich exprimiert und durch ihre Annotation in Metabolismus oder Signaltransduktion eingebunden sind. Eine höhere konstitutive Expression konnte in neun selektierten Contigs (u.a. 3 CytP450, 3 GST, 1 GT) auch in der F2 Generation bestätigt werden, cosegregierend mit den resistenten Phänotypen. Daher ist die Expression von mindestens neun Genen mit metabolischer Diclofop-methyl Herbizidresistenz gekoppelt und vererbbar. Eine Vorbehandlung sensitiver Weidelgras-Pflanzen mit 2,4-D induziert metabolische Resistenz gegenüber dem ACCase Inhibitor Diclofop-methyl. Dies wurde verwendet, um die Expression der 28 selektierten Contigs zusätzlich physiologisch zu validieren. Sieben der neun zuvor beschriebenen Contigs sind in der physiologischen Validierung auch in sensitiven Pflanzen durch 2, 4-D induziert. Diese Ergebnisse bieten neue Diagnosemöglichkeiten und verdeutlichen den Zusammenhang zwischen einer vererbbaren Expressionsregulierung von Resistenz vermittelnden Genen und der schnellen Entwicklung von MBHR.

Stichwörter: 2,4-Dichlorophenoxyessig Säure (2, 4-D), Diclofop-Methyl, Evolution, Herbizidmetabolisierung, Herbizidresistenz, Next-Generation Sequenzierung, transkriptionelle Marker, Transkriptomic

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Veröffentlicht

2014-02-11

Ausgabe

Rubrik

Sektion 1: Herbizidresistenz - Methoden / Herbicide resistance - methods