Verwendung molekularer Marker für die Überprüfung der Zuchtformel und zur Differenzierung von Hybridsorten bei Winterraps

Use of molecular markers for checking the hybrid formula and discriminating hybrid varieties in winter oilseed rape

Blattmaterial von je 2 x 40 Einzelpflanzen wurde kodiert an die Labore versandt und dort als Mischproben analysiert. Die Mischproben wurden aus gleichen Gewichtsanteilen jeweils einer Blattspitze pro Einzelpflanze zusammengestellt und dann der DNA-Extraktion unterzogen. Die PCR-Bedingungen wurden laborintern auf das jeweils verwendete Detektionssystem optimiert. Zunächst war nur für 8 kodierte Hybriden ihre Zuordnung zu den kodierten Elternlinien bekannt, um von den Laboren die DNA-Fragmentgrößen besser bestimmen zu können.

Insgesamt wurden 36 verschiedene Mikrosatellitenmarker getestet. Dabei handelte es sich um 26 frei verfügbare Marker aus der BrassicaDB von EMBL, die von NIAB (UK) und GEVES (FR) für Anwendungen in der Sortenprüfung vorselektiert waren (http://ukcrop.net/brassica.html#brassicadb). Diese wurden durch eine Auswahl von 10 neueren Mikrosatellitenmarkern (Piquemal et al., 2005) ergänzt. Das erstgenannte Set aus 26 Mikrosatellitenmarkern wird in einem vom Gemeinschaftlichen Sortenamt geförderten Verbundprojekt zum Management der Referenzkollektion bei Winterraps verwendet, an dem Sortenprüfämter aus Großbritannien, Frankreich, Dänemark und Deutschland beteiligt sind.

Ergebnisse

Eine kodominante Auswertung der DNA-Fragmentmuster war problematisch, weil unerwartet einige Elternlinien mehr als 2 Signale je Marker zeigten. Der Polymorphiegrad je Marker lag durchschnittlich bei 3 und maximal bei 6 polymorphen Signalen (Tab. 1). Die Wiederholbarkeit auf Basis von je 2 unabhängigen Mischproben (A- und B-Proben) war innerhalb der Labore sehr gut (BAZ: 100% Wiederholbarkeit; SURL: 99,3%) Die Übereinstimmung zwischen Laboren war problematischer, weil der Einfluss der unterschiedlichen Gerätesysteme und der Reagenzien die Abgleichung der DNA-Fragmentgrößenbestimmung zwischen den Laboren erschwerte.

Bei wenigen Markern konnten einzelne Signalausprägungen nur in einem der Labore bei wenigen Sorten detektiert werden, während im jeweils anderen Labor diese Ausprägungsstufen nicht auftraten. Die Intensität der Signale fiel zum Teil laborspezifisch unterschiedlich aus, so dass bei einzelnen Markern die Auswahl der auswertbaren Signale voneinander abwich, obwohl der Marker in jedem Labor einzeln betrachtet eindeutige und reproduzierbare Ergebnisse lieferte.

Bei bekannter Zuchtformel waren die Fragmentmuster deutlich zuverlässiger ansprechbar sowohl in Bezug auf die Fragmentgröße als auch hinsichtlich der Intensitätsgrenze, ab welcher ein Signal als relevant angesprochen wurde. Im Vergleich zum Blindversuch (Abb. 1A) reduzierte sich bei bekannter Zuordnung der Eltern (Abb. 1B) die Anzahl jener Signalausprägungen, die sich als unerwartet herausstellten, deutlich.

Abb. 1. Anzahl Signalausprägungen, die aufgrund der Zuchtformel nicht zu erwarten waren (basierend auf 25 ausgewerteten Markern); A.: Blindversuch; B.: mit bekannter Zuordnung der Elternlinien.

Insgesamt führten die Auswertungen bei vier Hybriden zu stärkeren Abweichungen vom erwarteten Signalmuster. Bei geringfügigen Unterschieden stimmten dabei die Ergebnisse beider Labore gut überein (Tab. 3). Bei den meisten von der Erwartung abweichenden Auswertungsergebnissen handelte es sich um Abweichungen vom Typ 2 (vgl. Tab. 2); Abweichungen vom Typ 1 traten in einigen Fällen auf, während solche vom Typ 3 sehr selten waren.

Die Variation der GS-Werte und der Mittelwert waren in beiden Laboren jeweils nahezu übereinstimmend (Tab. 4). Hybriden waren untereinander ähnlicher als Linien untereinander. Ein Linienpaar war in einem der Labore nicht unterscheidbar (DNA-Fragmentmuster in der A- und B-Probe identisch; GS= 1,0). In dem anderen Labor konnte in einem Marker ein Fragmentgrößenunterschied gefunden werden. Dieser Marker zeigte über alle untersuchten Genotypen betrachtet eine unterschiedliche Anzahl polymorpher Banden in den Laboren. Ein kerngenetischer Unterschied zwischen den beiden betreffenden Linien war nicht zu erwarten, da es sich um eine sterile Linie und den Maintainer handelte. Die Ähnlichkeit zwischen Linien und Hybriden war erwartungsgemäß höher als zwischen Linien. Die höchste Ähnlichkeit wurde zwischen den Hybriden gefunden.

Die Unterschiede im detektierten Signalmuster zwischen den beiden Laboren resultierten in Differenzen zwischen den paarweisen GS-Werten je Labor, wobei die Differenz im Einzelfall absolut bis zu 0,19 Einheiten unabhängig von der Materialgruppe (Elterlinien vs. Hybriden) variierte. Die Häufigkeitsverteilung der absoluten Differenzen ist in Abb. 2 dargestellt. Die Korrelation der GS-Werte zwischen den Laboren wird in Abb. 3 gezeigt.

Abb. 2. Häufigkeitsverteilung der absoluten Differenzen zwischen GS-Werten der beiden Labore für alle paarweisen Vergleiche.

Abb. 3. Korrelation der GS für alle Paare von Versuchsgliedern auf Grundlage der BAZ- und SURL-Daten.

In vielen Fällen zeigten die Hybriden eine relativ hohe Ähnlichkeit zu einer der Elternlinien. Die genetische Ähnlichkeit ist jedoch nicht geeignet, Eltern einer Hybride ohne Kenntnis der Zuchtformel zu identifizieren.

Zur Visualisierung wurden über alle Hybridsorten (H) und Elternlinien (L) Dendrogramme mit der UPGMA-Methode erstellt (Abb. 4). Der Mantel-Z-Test ermöglicht eine Abschätzung über die Übereinstimmung der Dendrogramme auf Grundlage der beiden Labore, welche mit r = 0,9 als sehr gut zu beurteilen ist.

Abb. 4. UPGMA-Dendrogramm für 42 Hybriden, basierend auf 27 Mikrosatellitenmarkern; Ähnlichkeitsmaß Jaccard; A.: Labor SURL; B.: Labor BAZ.

Von den Abweichungen zwischen Markerbefunden und Erwartung, die auch nach Bekanntgabe der Elternlinien-Zuordnung an die beiden Labore bestehen blieben, waren die meisten vom Typ 2, bei welchem das in einer der beiden Hybrideltern vorhandene Markerfragment in der Hybride nicht nachweisbar war. Deutlich weniger Abweichungen waren vom Typ 1 oder 3. Es ist davon auszugehen, dass der größte Teil dieser unerwarteten Ergebnisse nicht auf methodische Fehler, sondern auf genetische Ursachen zurückzuführen ist. In vorliegender Studie wurde mit Mischproben gearbeitet, wobei die untersuchten Einzelpflanzen der Elternlinien nicht identisch mit jenen waren, die zur Herstellung der ebenfalls untersuchten Hybriden verwendet worden waren. Es ist nicht auszuschließen, dass zwischen den zur Saatgutherstellung verwendeten und den untersuchten Elternlinien aufgrund von Restheterozygotie geringe genetische Unterschiede auf Markerebene existieren. Restheterozygotie einzelner Elternlinien kann, in Abhängigkeit vom Anteil des betreffenden Marker-Allels in der Mischprobe, zu positiven oder negativen PCR-Amplifikationsergebnissen und letztlich zu einem der drei Abweichungstypen (Tab. 2) führen. Gesicherte Aussagen zu den Ursachen der verschiedenen Abweichungen und zum Ausmaß sortenspezifischer Abweichungen würden Einzelpflanzenanalysen von tatsächlichen Kreuzungseltern und Individuen der Sorte aus anderen Vermehrungen erfordern. Insbesondere bei den vier durch starke Abweichungen auffallenden Hybriden können Fehler in der Hybridproduktion nicht ausgeschlossen werden. Alle vier betreffenden Hybriden sind vor Abschluss der Prüfung zurückgezogen worden, so dass keine Aussage hinsichtlich der Homogenität in morphologischen Merkmalen gemacht werden kann.

Bemerkenswert an den Laborergebnissen ist, dass trotz unterschiedlicher Darstellungsmethodik für die Markeranalysen die ermittelten mittleren genetischen Ähnlichkeiten für die beiden Labore sehr ähnlich, wenn nicht identisch, ausfielen und die Korrelation der GS-Werte zwischen den Laboren sehr eng war. Zusammen mit der guten Wiederholbarkeit der Ergebnisse innerhalb der Labore und der annähernd gleichen Anzahl persistenter Abweichungen (43 vs. 45, ohne die vier stark abweichenden Hybriden; Tab. 3) spricht dies für eine allgemein hohe und praktisch identische Präzision der in den beiden Laboren durchgeführten Analysen.

Dennoch bleiben kleinere Unterschiede im Einzelfall, die zeigen, wie wichtig die Harmonisierung der Methodik zwischen verschiedenen Laboren ist, um nicht nur sehr gut übereinstimmende, sondern zweifelsfreie Ergebnisse bei der amtlichen Untersuchung von Rapsmischproben mit Mikrosatellitenmarkern zu erhalten. Um identische Ergebnisse in verschiedenen Laboren zu ermöglichen und somit zwischen Abweichungen aufgrund genetischer Ursachen und Abweichungen aufgrund anderer Einflüsse unterscheiden zu können, wären detaillierte Richtlinien über die Verwendung von robusten Markern, definierten Reagenzien und Detektionstechnik unerlässlich.

Die vorliegende Studie zeigt des Weiteren, dass die Überprüfung der Zuchtformel nicht ohne Kenntnis des Sortentyps und der Hybrideltern möglich ist. Aufgrund gewisser Anteile von Restheterozygotie in den Linien kann nicht immer vom DNA-Fragmentmuster per se auf den Sortentyp geschlossen werden. Die Plausibilität der Zuchtformel kann relativ gut abgeschätzt werden, wenn die Elternlinien bekannt sind und die Ergebnisse in den Laboren übereinstimmen.

Die Entwicklung einer praktikablen Methodik zur eindeutigen Sortenidentifizierung erfordert weitere Untersuchungen. Mit den verwendeten 27 Markern unterschieden sich einige Hybriden nur in wenigen DNA-Fragmenten. Es wäre unter anderem zu prüfen, welche Unterschiede in den DNA-Fragmentmustern unter Beachtung der labortechnischen Aspekte hinreichend robust sind. Auch könnten Untersuchungen an Einzelpflanzen sowie an definierten Saatgutpartien aus verschiedenen Produktionsstufen und Produktionszyklen helfen, abweichende Signalmuster in den Hybriden zu bewerten. Durch Einsatz neuer Marker könnte gegebenenfalls der Polymorphiegrad erhöht und die Auswertbarkeit verbessert werden.

Zusammenfassend haben die Untersuchungen gezeigt, dass es nicht möglich ist, aus allen Elternlinien die zu einer gegebenen Hybride gehörenden Eltern zuzuordnen. Eine zusätzliche Schwierigkeit besteht dann, wenn nicht bekannt ist, bei welchen Proben es sich um solche von Hybriden bzw. von Linien handelt. In einigen Fällen ist die Anzahl der DNA-Fragmentmuster diesbezüglich kein ausreichender Indikator. Eine eindeutige blinde Zuordnung von Hybriden und ihren Elternlinien wäre nur möglich, wenn die Marker kodominant und eindeutig auswertbar sind, der Satz ausgewählter Marker das Material stark genug differenziert und methodisch bedingte Abweichungen in den DNA-Fragmentmustern ausgeschlossen werden können. Da in vorliegender Studie für die meisten Hybriden nur relativ geringfügige Abweichungen von den erwarteten DNA-Fragmentmustern auftraten, scheint die hier angewandte Strategie indessen dazu geeignet, die Plausibilität von Zuchtformeln nachzuprüfen.