Verwendung von inertem Kultivierungsmaterial zur semi-sterilen Vermehrung von Kartoffelkrebs für Labor-Versuchszwecke nach der Glynne-Lemmerzahl Methode

Use of inert cultivation material for semi-sterile amplification of potato wart for lab-experiments applying the Glynne-Lemmerzahl method

Einleitung

Der Kartoffelkrebserreger Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. ist ein obligat biotropher Quarantäne­erreger, der in vielen Ländern zunehmend an Bedeutung gewinnt. Auch in Deutschland treten immer wieder neue Kartoffelkrebsherde in landwirtschaftlich genutzten Gebieten auf (Stachewicz et al., 2005). Diese Krebsherde werden zurzeit von den drei vorherrschenden Pathotypen 2, 6 und 18 verursacht. Der Pathotyp 1 tritt durch die züchterischen Erfolge in Deutschland nicht mehr neu auf.

Alle 4 Pathotypen werden zur Bestimmung der Krebsresistenz bei neuen Sorten und Linien im Julius Kühn-Institut (JKI) mit der Labor-Resistenzprüfmethode nach Glynne (1925) und Lemmerzahl (1930 und 1931) verwendet. Durch die biologische Besonderheit des obligat biotrophen Pilzes kann dieser nur auf meristematischem Gewebe vermehrt werden, wofür in erster Linie Keim­linge von Kartoffelknollen verwendet werden. Bei der Glynne-Lemmerzahl-Methode wird der hohe Infektionsdruck auf die Keimlinge der Kartoffelknolle ausgenutzt, der durch das schnelle Schwärmen der Zoosporen aus den Sommersori entsteht. Die Inokulationsperiode und die weitergehenden Reinfektionen in der Komposterde finden dann in speziellen Behältnissen und Klimabedingungen statt. Im Laufe der 20-tägigen Inkubation kommt es zu weiteren Reinfektionen durch freigesetzte Zoo­sporen im Boden bzw. im Kompost. Deutlich sichtbare Krebswucherungen entstehen bei anfälligen Kartoffelsorten, die der Krankheit auch ihren Namen gegeben haben (Abb. 1).

Abb. 1. Natürliche Krebswucherung an einer anfälligen Kartoffelsorte, konserviert in Alkohol.

Treffen die Zoosporen hingegen auf Keime einer resistenten Kartoffelsorte, findet eine sofortige Abwehrreak­tion am Keim statt. Diese Reaktion ist dann später als Nekrose an einem normal gewachsenen Keim sichtbar (Abb. 2).

Abb. 2. Abwehrreaktion der gegen den Krebspathotyp 18 resistenten Kartoffelsorte „Tomana“, sichtbar am nekrotisierten Bereich an der Stängelbasis. Die Infektion erfolgte nach der Glynne-Lemmerzahl-Methode unter Laborbedingungen. Im Bildinnern eine Nahaufnahme einer Resistenzreaktion im Kartoffelkeimgewebe.

Obwohl die Komposterde vor ihrem Einsatz gedämpft wird, ist mit einem hohen Grad an Verunreinigungen von Bodenbakterien und Bodenpilzen zu rechnen, die sich in Form von Dauersporen der Behandlung widersetzen können. Gerade wenn Untersuchungen am Kartoffelkrebs durchgeführt werden sollen, bei denen es auf die ausschließliche Infektion von Zoosporen ohne Begleit­flora (Bodenbakterien, Pantoffeltierchen etc.) ankommt, ist der Ersatz des Komposts durch andere, künstliche Materialien wünschenswert.

Alle für diese Versuche verwendeten Augenplatten (aus Effizienzgründen wurden nur Teile einer Kartoffelknolle, die einen Keim enthalten, als viereckige Kartoffelstücke ausgeschnitten) wurden nicht, wie sonst üblich, in einer Monceren^®-Lösung (Fa. Syngenta, 2 ml/l) tauchgebeizt, sondern mit der gleichen Lösung besprüht. Diese Sprühbehandlung erwies sich als ebenso effektiv wie die Tauchmethode in Monceren^®-Lösung. Allerdings ist es empfehlenswert, bei dieser Sprühbehandlung mit Atemschutz zu arbeiten. Als Impfmaterial wurden Wucherungen des Pathotyps 18 verwendet, da dieser als sehr aggressiv und vital gilt.

Abb. 3. Wucherungen des Pathotyps 18, entstanden unter feuchtnassen Vliestuchlagen. Nur an den Keimspitzen kam es zur Ausbildung von Krebswucherungen, was zu einer baumartigen Ausbildung der Wucherungen führte.

Abb. 4. Links: Holzschnitzel/Fertigerde-Gemisch 50/50%. Rechts: 100% Kompost.

Deshalb wurde im nächsten Schritt untersucht, ob der Kompost nicht schrittweise weggelassen werden kann und schließlich komplett durch Sägemehl ersetzbar ist. Mischungen aus 80% Sägemehl und 20% Kompost wurden erprobt. Da sich hier ebenfalls keine Unterschiede in der Größe der Wucherungen ergaben, wurde der Kompost bei den weiteren Versuchen völlig weggelassen.

Im Vergleich zum Perlit und zu angefeuchteten Leinentüchern zeigten sich bei Verwendung von Sägemehl deutlich größere Krebswucherungen. Dabei hatte die Herkunft des Sägemehls keinen messbaren Einfluss auf die Größe der Wucherungen. Im Vergleich zum Kompost ergaben sich bei den Wucherungen in Buchen-Sägemehl keine Größenunterschiede (Abb. 5a und 5b).

Abb. 5. Krebswucherungen (Pathotyp 18) in Kompost (links) und in Buchen-Sägemehl (rechts).

Abb. 5. Krebswucherungen (Pathotyp 18) in Kompost (links) und in Sägemehl (rechts).

Eine Bonitur von Wucherungen unterschiedlich anfälliger Kartoffelsorten, gewachsen in Kompost und im Vergleich dazu in Sägemehl, zeigte die gleichen Bonitur­noten (Tab. 1). Selbst bei Verwendung von harzhaltigem Sägemehl aus Nadelholzmischungen waren keine Unterschiede bei der Bonitur der Wucherungen festzustellen. Zu sehen ist auch die typisch viereckige Augenplattenform der zurechtgeschnittenen Kartoffelknollen.

Allerdings war die Größe der Holzpartikel entscheidend für Anzahl und Ausbildung der Krebswucherungen, da diese über die Verteilung der Feuchtigkeit entscheidet, die den Zoosporen optimale Infektionsbedingungen verschafft. So ergab sich als optimale Größenverteilung der Holzpartikel eine gesiebte Größe von kleiner bis zu 1,25 mm bei 80%, wobei die restlichen 20% größer als 1,25 mm waren. Diese Größenverteilung wurde mit einer Holzmehlmischung von drei in der Umgebung von Braunschweig befindlichen Sägewerken erreicht.

Zum optimalen Wachstum des Kartoffelkrebses ist nicht die Versorgung der Wucherung mit Nährstoffen aus dem Kompost nötig, denn das Sägemehl enthält keinerlei Nährstoffe. Auch zeigten die im Holzmehl gebildeten Wucherungen die gleiche Anzahl von Sori unter dem Mikroskop (Abb. 6). Im Vergleich zum Kompost scheint die Wasserverdunstung im Sägemehl wesentlich geringer zu sein, weshalb auch während der 20-tägigen Inkubationszeit weniger gewässert werden musste. Unter dem Mikroskop waren deutlich weniger kontaminie­rende Mikroorganismen bei der Holzmehlvariante sichtbar als bei den in Kompost gewachsenen Wucherungen. Allerdings steht eine genaue Untersuchung, in welchem Maße die Kontaminationen reduziert werden können, noch aus.

Abb. 6. Mikroskopischer Ausschnitt von Kartoffelgewebe mit Sori des Kartoffelkrebs-Pathotyps 18 aus Kompost (a) und Sägemehl (b).

So sind in den Kartoffelknollen-Augenplatten genügend Nährstoffe vorhanden, um eine optimale Ausbildung der Wucherungen auch im nährstoffarmen Holzmehl zu ermöglichen. Das Bedeckungsmaterial dient einzig und allein zur Schaffung von feuchten Bedingungen für die Reinfektion der Keime mit den aus den Sommersori laufend freigesetzten Zoosporen.

Zum Erhalt von semi-sterilen Krebswucherungen eignet sich die Verwendung von Holzmehl auch deshalb besser als Kompost, weil sich die Keime bzw. Wucherungen wesentlich einfacher von den Holzpartikeln reinigen lassen, als es bei Verwendung von Kompost wegen seines hohen Humusanteils möglich ist. Um eine noch bessere Reinigung der Wucherungen von anhaftendem Material zu erreichen, bietet sich die Verwendung eines Staub­saugers an. Nach dem Abtrocknen der Keime lässt sich das Holzmehl bequem im Staubsaugerbeutel sammeln, wodurch sich eine Beseitigung des Quarantäneabfalls einfacher gestalten lässt; denn aus quarantänerecht­lichen Gründen ist eine sachgerechte Entsorgung des Abfalls notwendig vorgeschrieben.

Um in Zukunft wesentlich schneller kontaminationsfreie Wucherungen zu erhalten, sollten die zuerst verwendeten Kompost-Wucherungen desinfiziert werden, um in der nächsten Wucherungs-Generation den Gehalt an Bodenmikroorganismen so niedrig wie möglich zu halten. Hier würde sich beispielsweise Wasserstoff­peroxid empfehlen, da diese Chemikalie umweltfreundlich ist und alle Mikroorganismen gleichermaßen abtötet (Niepold, 1999). Zwar reagiert die Oberfläche der Kartoffelkrebs-Wucherungen ebenfalls mit dem Wasserstoffperoxid, aber die im Gewebe liegenden Sommersori werden wohl weitestgehend verschont bleiben. Eingehende Untersuchungen sind in Vorbereitung.

Erst bei wiederholten Reinokulationen der Wucherungen kann eine Keimfreiheit erzielt werden, was mit den im Holzmehl erhaltenen Wucherungen gezeigt werden soll. Auch wäre die Frage nach der Stabilität von Pathotypen in einem Vergleich zwischen den im Holzmehl und im Kompost erhaltenen Wucherungen zu klären. Ebenso könnte die Verwendung von in vitro Kartoffelknollen oder Kartoffelpflänzchen als bereits steriles Ausgangsmaterial sinnvoll sein, um sterile Wucherungen zu erhalten, aus denen man beispielsweise die bei der Wirt-Parasit-Interaktion entstandene mRNA ohne störende Fremd-RNA anderer Organismen gewinnen könnte.