Einfluss Kupfer-haltiger anthropogener Einträge auf Bodenmikroorganismen – eine Übersicht. I. Mikrobielle Populationen

Influence of anthropogenic copper pollution on soil microorganisms – an overview. I. Microbial populations

Während früher mikrobielle Diversitätsuntersuchungen im Boden vor allem auf „klassischen Populationsmethoden“ beruhten, haben moderne Nachweismethoden (z. B. Phospholipidfettsäureprofile PLFA, Denaturierungsgradienten-Gelelektrophorese DGGE, Substratnutzungsmuster BIOLOG) in den letzten Jahren zu einem Informationsgewinn geführt. Dementsprechend konzentriert sich die hierzu verfügbare Literatur vorwiegend auf die letzten 15 Jahre, wobei auch hier oft gemischte Schwermetallbelastungen durch Emissionen usw. im Vordergrund stehen. Bereits frühzeitig wiesen Zelles et al. (1994) darauf hin, dass es durch den langjährigen Einsatz Cu-haltiger Fungizide in Hopfenböden zu einem erhöhten Cu-Gehalt (150 mg/kg) und damit verbunden zu einer Veränderung der Mikroorganismengemeinschaft (z. B. Anstieg gram-positiver Bakterien) kommen kann. Auch in Böden von Obstanlagen und Weinbergen verursachte die langjährige Applikation Cu-haltiger Fungizide erhöhte Cu-Gehalte (z. B. 145,5 – 296,7 mg/kg), die wiederum toxisch gegenüber der Bakteriengemeinschaft sein können (Viti et al., 2008). In einem über 30 Jahre jährlich viermal mit Kupfersulfat belasteten Weinbergsboden und daraus resultierenden unterschiedlich hohen Cu-Gehalten (215 und 372 mg/kg) in zwei Anbaulagen ließen sich anhand des DGGE-Profils und von Bakterienisolaten ebenfalls Verschiebungen der Bakteriengemeinschaft feststellen (Dell’Amico et al., 2008). Zwar war an beiden Standorten der Anteil Cu-toleranter Bakterien hoch, doch herrschten im geringer mit Cu belasteten Boden gram-positive Bakterien vor, im höher belasteten dagegen gram-negative. Auch in einem dreijährigen Feldversuch verursachte die jährliche Applikation des Fungizids Bordeaux-Mischung (16 und 48 kg Cu/ha) erhöhte Cu-Gehalte im Boden (Ranjard et al., 2008). Während die wiederholte Anwendung der niedrigeren Dosierung zu einer erhöhten Stabilität der Mikrobengemeinschaft gegenüber dem Metallstress führte, induzierte die höhere eine veränderte, aber danach ebenfalls stabile Struktur der Bakterienpopulation. Zusätzlicher Klimastress kann diese Reaktionen beeinflussen. Aus ihrem Mikrokosmenexperiment mit einem unbelasteten (29,3 mg Cu/kg) und einem belasteten Boden (214 mg Cu/kg) schlossen Bernard et al. (2009), dass einige Bakterienpopulationen (z. B. Gammaproteobacteria) durch Kupfer gehemmt werden, während andere langsam wachsende dagegen gefördert werden. Ebenfalls in Mikrokosmen mit verschiedenen sandigen Böden applizierten du Plessis et al. (2005) in abgestufter Dosierung das Fungizid Kupferoxychlorid (0, 30, 100, 1000 mg Cu/kg) und erzielten damit EDTA-extrahierbare Cu-Gehalte von 0,83 – 1008,15 mg/kg. Bei der höchsten Dosierung war die mittels BIOLOG ermittelte Anzahl der von Mikroorganismen im Test verwerteten C-Quellen verringert. Während Bakterienpopulationen differenziert auf die Cu-Belastung reagierten, waren Protisten – speziell aus nicht kultivierten Flächen – generell empfindlich. In Vergleichsuntersuchungen mittels PLFA-Methoden von einem frisch mit Kupferchlorid (50, 200, 2000 mg Cu/kg) behandelten und einem früher in einer Holzschutzanlage mit Kupfer kontaminierten (3392 mg Cu/kg) und für die Versuche gemischten Boden wurden vorwiegend aerobe Bakterien dosisabhängig verringert (Wilke et al., 2005). Dieser Effekt war im Boden mit gealterten Cu-Rückständen ab der mittleren Dosierung ausgeprägter. Versuche mit gestaffelten Gaben von Kupfersulfat zu zwei Böden zeigten ebenfalls, dass sich die PLFA-Muster und damit die Struktur der Mikroorganismengemeinschaft im Boden mit steigender Dosierung (ab 75 mg Cu/kg) änderte (Yao et al. 2006). So erhöhte sich z. B. der Anteil gram-negativer Bakterien und die mikrobielle Diversität nahm ab. Im Laborversuch applizierte Pečiulyte (2001) Kupfersulfat (65 mg Cu/kg) zu Gartenboden und isolierte danach 378 Pilzkolonien, die 15 Gattungen und 29 Arten angehörten. Durch Kupfer wurden potenziell phytopathogene Pilze der Gattung Acremonium, Cylindrocarpon und Nigrospora und Antagonisten der Gattung Gliocladium stimuliert, andere jedoch verringert. Unter Laborbedingungen mischten Moreno et al. (2003) Kupfersulfat (3 g Cu/kg) in einen Boden, wovon bereits nach 24 h ein Großteil des Cu sorbiert war. Die Anzahl Bakterien und Pilze wurde zwar nicht beeinträchtigt, doch wurde die mikrobielle Diversität verringert und gram-positive Stäbchen-Bakterien und Pilze gefördert. Davon waren 140 Stämme gegenüber hohen Cu-Konzentrationen (50, 140 und 310 mg/L) tolerant, darunter besonders Bacillus und Penicillium. In Gefäßversuchen mit vier australischen Böden verursachten gestaffelte Dosierungen von Kupfernitrat (60 – 1500 mg Cu/kg) ebenfalls eine dosisabhängige Beeinträchtigung der funktionalen mikrobiellen Diversität (BIOLOG) und Biomasse, wobei nach 45 Tagen die Wirkung erst ab 300 mg Cu/kg auftrat, nach 270 Tagen jedoch bei allen Dosierungen (Banu et al., 2004).

Einige Veröffentlichungen zur Situation von Weinbergs- und ähnlichen – oft langjährig mit Kupfer kontaminierten – Böden weisen auf die Cu-Gefährdung hin. So wuchsen in einem Gefäßversuch mit Boden, der 13 Jahre zuvor u. a. einer Cu-Belastung (750 kg/ha) ausgesetzt war, Testpflanzen (Agrostis capillaris) zwar schwächer, doch wurde die Bakterien- und Protozoenanzahl nicht beeinflusst (Boon et al., 1998). In einem mit verschiedenen Dosierungen von Kupfersulfat kontaminierten Boden waren nach 6 Jahren noch 42,3 bzw. 189,6 mg Cu/kg vorhanden (Szili-Kovacs, 2008). Hier war jedoch bereits beim niedrigen Cu-Gehalt die Anzahl Aktinomyzeten sowie copiotropher und oligotropher Bakterien leicht reduziert, während die Pilzzahl unbeeinflusst blieb. Eine mehr als 50-jährige Cu-Kontamination verschiedener Böden (12 – 3000 mg Cu/kg) beeinträchtigte sowohl Pilze, Bakterien und Aktinomyzeten im Boden (Dumestre et al., 1999). Dabei trat mit steigenden Cu-Gehalten eine Tendenz zu größeren Populationen Cu-toleranten Bakterien, Aktinomyzeten und Pilze auf. Esswein und Schwartz (1939) hatten bereits sehr früh festgestellt, dass nach der Anwendung von Bordeaux-Brühe und Kupfersulfat die Anzahl Algen und heterotropher Bakterien in Weinbergsböden reduziert war. Dagegen wurde in Obstanbauböden auf der Krim, in denen der Cu-Gehalt durch 10-jährige Anwendung von Cu-Fungiziden auf 40 – 180 mg/kg angestiegen war, eine Tendenz zu erhöhten Bodenpilzzahlen beobachtet (Ivanova, 1987). Die Anwendung von Kupferoxychlorid zu Kartoffeln (Solanum tuberosum) verursachte – ähnlich wie andere Fungizide – eine Verringerung der Pilz- und Bakterienpopulation, wobei der Effekt in der Rhizosphäre deutlicher ausfiel als im Boden (Shukla et al., 1987). In japanischen Weinbergsböden wurde eine positive Korrelation zwischen den Cu-Gehalten und der Isolierungshäufigkeit Cu-resistenter Streptomyceten gefunden (Hayakawa et al., 1982). Zur Simulation einer Cu-Belastung von Weinbergsböden applizierten Courde et al. (1998) 4 Jahre lang jeweils 12 bzw. 50 kg Kupfersulfat pro ha und erzielten Cu-Gehalte im Boden zwischen 12 und 90 mg/kg. Hierdurch wurden Bakterien- und Pilzpopulationen verringert. Einzelne Bakteriengruppen wurden unterschiedlich durch 50 kg/ha beeinflusst: Arthrobacter, Nitrosococcus, Bacillus und Variovorax wurden mehr oder weniger deutlich stimuliert, Pseudomonas, Rhizobium und Alcaligenes dagegen gehemmt. Die langjährige Anwendung Cu-haltiger Fungizide hatte in spanischen Weinbergböden zu Cu-Gehalten von 35 bis 550 mg/kg geführt (Diaz-Raviña et al., 2007). Parallel dazu mittels „Thymidin- und Leucin-Incorporation-Technique“ durchgeführte Untersuchungen zeigten in Böden mit mehr als 100 mg Cu/kg eine Beeinträchtigung anhand der erhöhten Cu-Toleranz der Bakterien. Zancan et al. (2006) fanden in Weinbergsböden, die infolge der früheren Anwendung von Cu-Fungiziden (z. B. Kupferoxychlorid) gegenüber den anderen Standorten einen erhöhten Cu-Gehalt von 53 mg/kg aufwiesen, weniger Algen (z. B. Chlamydophyceen, Chlorophyceen) und Cyanobacteria als in weniger belasteten Böden. Allerdings ist anhand der Versuchsanordnung der Einfluss weiterer Faktoren nicht auszuschließen.

In zahlreichen Labor- und Feldversuchen wurde weiterhin der Einfluss verschiedener anorganischer Cu-Verbindungen – darunter sehr häufig Kupfersulfat – auf zahlreiche Bodenmikroorganismen untersucht. Die Anwendung hoher Dosierungen von Kupfersulfat (200 und 2000 mg Cu/kg) reduzierte die Populationen von Pilzen, Bakterien und Aktinomyzeten in einem Tonboden, während diese in einem Sandboden teilweise stimuliert wurden (Hemida et al., 1997). In einem Gefäßversuch mit Ackerbohnen (Vicia faba) testeten Kucharski et al. (2000) die Reaktion zahlreicher Mikroorganismengruppen gegenüber verschiedenen Dosierungen (20 – 100 mg Cu/kg) von Kupfersulfat. Dabei kam es – meistens deutlicher im mit Nitragin beimpften Boden – teilweise zu dosisabhängigen Veränderungen mikrobieller Populationen: Tendenziell stimuliert durch Kupfersulfat wurden im Nitragin-Boden Pilze, Aktinomyzeten, oligotrophe Bakterien, copiotrophe Bakterien mit und ohne Sporen sowie Ammonifikanten, während N-Immobilisierer und Azotobacter ab 100 mg Cu/kg verringert wurden. In einem weiteren Gefäßversuch mit einem lehmigen Sandboden und Sommergerste wurde ebenfalls Kupfersulfat (400 – 1200 mg Cu/kg) sowohl mit als auch ohne eine Beimpfung mit Streptomyces viridis bzw. S. odorifer appliziert (Kucharski und Wyszkowska, 2004). Wie Tab. 1 am nicht beimpften Boden zeigt, wurden alle untersuchten mikrobiellen Populationen – darunter auch Bodenpilze – durch Kupfersulfat dosisabhängig verringert, wobei oligotrophe Bakterien am stärksten reagierten. Die beimpften Böden verhielten sich weitgehend ähnlich. Raguotis (1999) behandelte einen podsolierten Sandboden mit Kupfersulfat (50 bis 10000 mg Cu/kg) und untersuchte 2 Monate danach zahlreiche mikrobielle Populationen. Bakterien auf verschiedenen Nährböden wurden durch 50 und 100 mg Cu/kg stimuliert, ab 500 mg/kg dagegen – wie Aktinomyzeten insgesamt – dosisabhängig reduziert. Pilze wurden indessen weniger beeinflusst und waren ab 5000 mg Cu/kg sogar zahlreicher. Cellulolyten, Clostridium pasteurianum, Nitrifikanten und Denitrifikanten wurden meistens erst ab 1000 mg Cu/kg stärker verringert. Kostov und van Cleemput (2001) behandelten einen sandigen Lehm- und einen Sandboden mit hohen Dosierungen von Kupfersulfat (500, 1500 und 3000 mg Cu/kg) und beobachteten ebenfalls unterschiedliche mikrobielle Reaktionen: Während Bakterien ab 500 mg Cu/kg je nach Boden um 31,3% bzw. 26,3% und Streptomyceten um 41,4% bzw. 70% verringert wurden, waren Pilze toleranter und wurden sogar vorübergehend um 10,6% bzw. 200% stimuliert. Durch höhere Dosierungen (ab 1500 mg Cu/kg) wurden jedoch die Pilze ebenfalls – allerdings nur im Sandboden – dosisabhängig verringert. Auch die Behandlung eines Alfisols mit Kupfersulfat (87 – 676 mg Cu/kg) veränderte mikrobielle Populationen (Olayinka und Babalola, 2001). Bakterien wurden bereits ab 87 mg Cu/kg um 87,1% und Nitrifikanten um 5,5% reduziert, Pilze dagegen um 75,2% gefördert. Die höheren Dosierungen ab 348 mg Cu/kg wirkten hier ebenfalls bei Pilzen stark stimulierend. Dadurch veränderte sich auch das Verhältnis von Bakterien zu Pilzen von 2352:1 im Kontrollboden zu 2,5:1 bei der höchsten Cu-Belastung. Levinskaite (2001) beobachtete die Reaktion von 32 Isolaten von Penicillium-Arten gegenüber Kupfersulfat (0,2 – 10 mM Cu) in vitro und fand eine unterschiedliche Toleranz. Am empfindlichsten gegenüber 0,2 mM Cu waren P. implicatum (30,7% Hemmung), P. atramentosum (28,6%) und P. chermesinum (26,5%), während P. ochrochloron (92,8% Hemmung), P. expansum (94,3%) und P. humuli (94,7%) am tolerantesten gegenüber 5 mM Cu waren. In anderen Untersuchungen wurde kurz nach der Applikation hoher Dosierungen von Kupferchlorid (1500 und 2500 mg Cu/kg) zum Boden die Anzahl kultivierbarer Bakterien deutlich verringert, doch stieg sie während der nachfolgenden Bebrütung wieder an (Piotrowska-Seget und Kozdroj, 2008). Kurz nach der Cu-Kontamination dominierten gram-positive Bakterien. Es scheint, dass eine oder wenige Metall-tolerante Populationen die Bakteriengemeinschaft dominieren können. Auch anhand der Differenzierung des Einflusses verschiedener Cu-Bindungsformen in einem in der Nähe einer Kupferhütte entnommenen Boden stellten Sun et al. (2006) fest, dass die Toleranz einer Bakteriengemeinschaft im belasteten Boden anstieg, während empfindliche Bakterien abnahmen. Dabei scheint der Einfluss des austauschbaren Kupfers auf die Toxizität größer zu sein als der anderer Bindungsformen.

In ihren Untersuchungen mit vier bakteriologischen Toxizitätstests fanden Horvath et al. (1997) bei Cu-kontaminierten Boden- und Sedimentproben (16 bis 6140 mg/kg) eine ausgeprägte Empfindlichkeit des freilebenden Azotobacter agile. In Gefäßversuchen reduzierte Kupferchlorid ab 367,7 mg Cu/kg Azotobacter chroococcum dosisabhängig (Athar und Ahmad, 2002). Die Stickstoffbindung durch heterotrophe freilebende Bakterien wurde in vitro durch 50 mg Cu/kg (als Chlorid) gehemmt, die der etwas resistenteren Stickstoff-bindenden Cyanobacteria dagegen erst durch 125 mg Cu/kg (Mårtensson, 1993). Auch Kupfer in Acetatform erwies sich mit 0,05 – 50 mM/kg als hemmend (bis 20%) gegenüber Azotobacter spp. (Nowak et al., 2001).

Dias-Junior et al. (1998) fanden kein Azospirillum spp. in mit Schwermetallen, darunter 8 bis 887 mg Cu/kg, belasteten Böden. Dagegen hatte eine fungizide Bordeaux-Mischung in vitro keinen negativen Einfluss auf Azospirillum sp. (Raji und Pillai, 2000). Kupfersulfat zur Simulierung einer Cu-Belastung hemmte indessen einzelne Stämme von Azospirillum sp. – einem potenziellen Bestandteil von Biodüngern – in vitro bereits ab 25 mM Cu/L dosisabhängig, andere dagegen erst ab 200 (Biro et al., 1995). Auch in Acetatform hemmte Kupfer ab 10 mg/kg Azospirillum sp. (Strzelczyk et al., 1997).

In Gefäßversuchen, in denen Kupfer über Ionenaustauscher appliziert wurde, fanden Kopittke et al. (2007) bereits ab 0,2 µM eine 10%-ige Hemmung der Knöllchenbildung durch Rhizobium, beim Wachstum der Leguminose Vigna unguiculata (Cowpea) aber erst ab 1,0 µM. Dem steht die relativ geringe Empfindlichkeit von Rhizobium gegenüber Kupfer aus einem langjährig mit Klärschlamm versetzten Boden in einem Lumineszenz-Biosensortest entgegen (Chaudri et al., 2000). Dort hatte ein Cu-Gehalt von 620 µg/L in der Bodenlösung, was etwa 349 mg Cu/kg im Boden entspricht, keinen signifikanten Einfluss. Die Samenbeizung mit dem Fungizid Kupferoxychlorid gegen phytopathogene Pilze hemmte die Knöllchenbildung durch Rhizobien bei den Leguminosen Lablab purpureus, Phaseolus vulgaris und Vigna radiata (Muthomi et al., 2007). Eine Bodenapplikation des Fungizids (als Copperthom) reduzierte die Knöllchenanzahl nur zeitweise bei den Leguminosen Dolichos biflorus und Vigna mungo, aber nicht bei Cajanus cajan und V. unguiculata (Udaiyan et al., 1995). Ein anderes Fungizid, nämlich die Bordeaux-Mischung, hemmte das symbiontische Bakterium Bradyrhizobium sowohl unter Laborbedingungen als auch zeitweise im Freiland in der Rhizosphäre von Vigna unguiculata (Raji und Pillai, 1996). Matsuda et al. (2002) führten Laborversuche mit Kupfersulfat zur Ermittlung der Cu-Toleranz zahlreicher Isolate verschiedener Rhizobien (Azorhizobium, Bradyrhizobium, Meso­rhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium) von mehreren Wirtspflanzen und unterschiedlich mit Schwermetallen belasteten Orten durch. Es zeigte sich, dass die Herkunft keinen Einfluss auf die Cu-Toleranz der Bakterien hatte. Die entsprechenden DT₅₀-Werte sind in Tab. 2 zusammengestellt. In einem Feldversuch applizierten Laguerre et al. (2006) 8 Jahre lang 12,5 und 50 kg Kupfersulfat pro ha und untersuchten Rhizobien-Populationen. Am Versuchsende 3 Jahre nach der letzten Applikation wiesen die Böden 14,0 bzw. 91,0 mg Cu/kg auf. Die Rhizobien an Vicia sativa wurden durch den höheren Cu-Gehalt verringert, nicht aber die an Phaseolus vulgaris. Die Diversität der Rhizobien-Genotypen wurde durch die Cu-Anwendung nicht verändert. In einem Feldversuch mit Rhizobium-Beimpfung zu „greengram“ (Vigna radiata) erhöhten 2,5 mg Cu/kg als Kupfersulfat zwar die Knöllchenbildung, bereits 5 mg/kg hemmten jedoch (Prasad und Ram, 1988). Auch bei Sojapflanzen (Glycine max) verringerte Kupfersulfat die Knöllchenbildung durch Rhizobium japonicum zeitweise (Kim, 1976). Mårtensson (1992) beobachtete in vitro bei Rhizobium spp. von kleinsamigen Leguminosen bereits eine Hemmung durch 10 mg Cu/L, wobei die einzelnen Stämme unterschiedlich empfindlich waren. Die Rhizobien reagierten teilweise sensibler als die nicht beimpfte Wirtspflanze Rotklee (Trifolium pratense).

Einige Cu-Fungizide wurden ebenfalls hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Mykorrhiza untersucht. Kupferoxychlorid (35,3 kg AS/ha) beeinflusste die Ektomykorrhiza (u.a. Suillus- und Cenococcum-Typen) an „Scots pine“ (Pinus sylvestris) nicht signifikant (Manninen et al., 1998). Aber in vitro wurden die meisten von 64 getesteten Ektomykorrhizapilzen (z. B. Cantharellus cibarius, Corticium bicolor, Paxillus involutus, Suillus spp.) durch 1 und 10 mg/L des Fungizids gehemmt (Laatikainen und Heinonen-Tanski, 2002). Unter Freilandbedingungen wurde auch die VA-Mykorrhiza (Glomus spp.) an verschiedenen Leguminosen durch das Fungizid (als Copperthom; 4 L/m²) verringert (Udaiyan et al., 1995).

Ergebnisse aus Versuchen, in denen Kupfersulfat zur Simulation erhöhter Cu-Gehalte im Boden eingesetzt wurde, lassen ebenfalls gewisse Rückschlüsse auf die Wirkung einer Cu-Belastung des Bodens zu. In Gefäßversuchen verringerte das als Fungizid eingesetzte Kupfersulfat (333,3 g/m³ blue copper) die Entwicklung der Ektomykorrhiza an Sämlingen von Pinus patula und P. caribaea, ohne jedoch die Lebensfähigkeit des Inokulums zu reduzieren (Singh et al., 1987). In vitro reagierten einige Ektomykorrhizapilze unterschiedlich empfindlich auf Kupfer in Sulfatform (Jones und Muehlchen, 1994): Während auf Nährböden Laccaria laccata bereits durch 10 mg Cu/L und Suillus variegatus durch 100 mg Cu/L gehemmt wurden, tolerierte Thelephora terrestris 100 und 500 mg Cu/L. Ebenfalls in vitro wurden 39 Isolate der Ektomykorrhizapilze Paxillus involutus, Pisolithus tinctorius, Suillus bovinus, S. luteus und S. variegatus gegenüber Kupfersulfat getestet (Blaudez et al., 2000). Auch hier reagierten die einzelnen Arten unterschiedlich: S. bovinus wuchs selbst bei 10 mg Cu/L nicht mehr, während P. tinctorius und S. luteus noch 30 mg Cu/L tolerierten. Dabei war es nicht ausschlaggebend, ob das Pilzisolat aus einem kontaminierten oder unkontaminierten Standort kam. Ebenfalls in Nährmedien mit Zusatz von Kupfersulfat wurden Isolate der Ektomykorrhizapilze Pisolithus tinctorius (EC₅₀ 1,18 mmol/L) und Scleroderma bovinus (EC₅₀ 0,12 mmol/L) mit steigender Cu-Konzentration gehemmt (Grazziotti et al., 2001). Allerdings wurde das Wachstum von P. tinctorius sogar durch niedrige Cu-Konzentrationen (ca. 0,5 mmol/L) begünstigt. Ein anderer Ektomykorrhizapilz (Xerocomus chrysenteron) wurde in vitro mit Cu-Konzentrationen von 10 bis 80 mg/L kontaminiert und danach sein Wachstum sowie die Proteinausscheidungen erfasst (Zheng et al., 2009). Der Pilz wuchs bei allen Dosierungen etwa gleich gut, lediglich seine APase-Aktivität nahm ab 30 mg Cu/L dosisabhängig ab. Damit erwies er sich als möglicher Kandidat zur Phytoremediation von mit Cu belasteten Böden.

Als Fungizid appliziert verringerte Kupfersulfat mit 112 und 224 kg Cu/ha zwar das Wachstum von „Sour orange“ (Citrus aurantium), aber nicht die Infektion und Sporulation des Endomykorrhizapilzes Glomus etunicatus (Nemec, 1980). Normalerweise ist zu erwarten, dass eine Mykorrhizainfektion zu einer verstärkten Aufnahme mineralischer Elemente durch die Pflanze führt. Von verschiedenen Ericaceen (Calluna vulgaris, Rhododendron ponticum, Vaccinium macrocarpon) isolierte endophytische Mykorrhizapilze wuchsen noch in einer Nährlösung mit bis zu 75 mg Cu/L (als Kupfersulfat), doch wiesen die Pflanzen in den Sprossen – nicht jedoch in den Wurzeln – geringere Metallkonzentrationen auf (Bradley et al., 1982). Auch bei den tropischen bzw. subtropischen Pflanzen Capsicum annuum, Eupatorium odoratum und Stylosanthes guianensis wurde weder die VA-Mykorrhizainfektion mit Glomus macrocarpus noch dessen Entwicklung durch niedrige Cu-Konzentrationen (als Kupfersulfat) von 0,2 bis 25 mg/kg verringert (Fabig, 1982). Die bei beimpften Pflanzen meist bessere P-Versorgung wurde nur durch die höchsten toxischen Elementgaben beeinträchtigt. In weiteren Untersuchungen reduzierte basisches Kupfersulfat [CuSO₄·3 Cu(OH)₂·H₂O] ab 19 bis 34 mg Cu/kg mit steigender Konzentrationen das Sämlingswachstum von „Carrizo citrange“ (Poncirus trifoliata x Citrus sinensis) und die Besiedlung mit dem VA-Mykorrhizapilz Glomus intraradices logarithmisch (Graham et al., 1986). Bei Zwiebeln (Allium cepa) führte Kupfersulfat nach Inokulation mit Glomus deserticola ab 320 mg Cu/kg bzw. mit G. fasciculatum bereits ab 240 mg Cu/kg zu verringertem Wachstum (Taleva und Djonova, 1998). Wan et al. (1998) beobachteten in ihrem Testsystem Daucus carota und dem VA-Mykorrhizapilz Glomus intraradices sogar bereits bei 6,25 mg/kg Kupfersulfat ein reduziertes Wachstum.

Auch einige Cu-haltige Pflanzenschutzmittel wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf antagonistische Bodenmikroorganismen untersucht. Während Machowicz-Stefaniak et al. (1998) bis 100 mg/L des Fungizids Kupferoxychlorid (Miedzian 50 WP) keinen Einfluss auf den Pilz Trichoderma harzianum sowie das Bakterium Pseudomonas fluorescens beobachteten, wurde der Pilz Gliocladium catenulatum dosisabhängig sowie das antagonistische Bakterium Bacillus sp. generell gehemmt. Auch in anderen Untersuchungen scheinen offensichtlich antagonistische Trichoderma-Arten durch das Fungizid kaum beeinträchtigt zu werden (Kolase et al., 2001).

Jedoch hemmte das als Mikronährstoff eingesetzte Kupfersulfat das Wachstum eines Stamms von Trichoderma viride in vitro bereits ab 10 mg/L dosisabhängig (Gao et al., 2008). Dagegen wurden in einem unter Laborbedingungen mit 65 mg Cu/kg als Kupfersulfat versetzten Gartenboden mehr gegen verschiedene Phytopathogene antagonistische Pilzarten (z. B. Gliocladium) gefunden (Pečiulyte und Lugauskas, 2001). Auch beobachteten Vagvölgyi et al. (2009) beim Test mit Kupfersulfat in vitro eine hohe Cu-Toleranz (bis etwa 300 mg Cu/L) von 20 aus dem Boden isolierten und gegen phytopathogene Pilze (z. B. Alternaria, Fusarium, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia, Sclerotium) antagonistischen Bakterien. Dabei erhöhten Cu-Konzentrationen bis über 100 mg/L sogar den antagonistischen Effekt. Gegen Kupfer empfindliche Mutanten von Pseudomonas fluorescens, die gegen Phytophthora parasitica antagonistisch waren, wurden jedoch bereits durch 10 bis 15 mg Kupfersulfat pro kg Boden stark verringert (Yang et al., 1993).

Das Fungizid Kupferoxychlorid verringerte zeitweise die Atmung von Metarhizium anisopliae im Boden (Mochi et al., 2005). Auch in Reinkultur wurde dieser Pilz durch eine praxisnahe Dosierung des Mittels deutlich reduziert (Rachappa et al., 2007). Ebenso kann die Verträglichkeit des Fungizids mit dem Bakterium Bacillus thuringiensis verringert werden (Bhattacharyya et al., 1998). Auch die multifunktionelle Verbindung Kupfersulfat im Boden beeinträchtigte die Entomopathogenität des Pilzes Paecilomyces fumoso-roseus (Jaworska et al., 1998). In vitro hemmte das mit 200 mg/L als Fungizid eingesetzte Kupfersulfat den Pilz Metarhizium anisopliae – ähnlich wie andere entomopathogene Pilze – kaum und lag damit etwa im Bereich verschiedener konventioneller Mittel (Luz et al., 2007). Verglichen mit anderen aus mit Kupfer belasteten Forstböden isolierten Pilzen wies Beauveria bassiana unter in vitro-Bedingungen eine relativ hohe Toleranz (ED₅₀ 250 mg Cu/L) gegenüber Kupfersulfat auf (Arnebrant et al., 1987). Andererseits beeinträchtigte das in vitro als Fungizid mit 2,5 g/L eingesetzte „Kosoide WP“ (Kupferhydroxid) die entomopathogenen Pilze Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae stark (Ahmed et al., 2001).

In ihren Untersuchungen hatten Renella et al. (2002) keine starken Effekte von frisch zugesetztem Kupfersulfat (140 mg Cu/kg) auf die mikrobielle Biomasse gefunden. Auch die Kombination mit Cd (12 mg/kg) und/oder Zn (300 mg/kg) in Sulfatform änderte wenig an diesem Verhalten. Xie et al. (2009) untersuchten die funktionale mikrobielle Diversität anhand von Substratnutzungsmustern in unterschiedlich gedüngtem und mit Kupferchlorid (100 mg Cu/kg) sowie dem Insektizid Cypermethrin (10 mg/kg) versetztem Boden. Kupferchlorid war nur gering wirksam. Dies wurde auch durch die Kombination mit dem in dieser Dosierung allein ebenfalls kaum wirksamen Insektizid nicht verändert. Weiterhin wurde die Kombination von Kupferoxid (128 mg/kg) mit dem Fungizid Mefenoxam (4 mg/kg) in Labormikrokosmen mikrobiell (Biomasse mittels Atmung, DGGE) untersucht (Demanou et al., 2006). Einzeln angewandt erhöhten beide Mittel vorübergehend den mikrobiellen Biomasse-Kohlenstoff, aber auch ihre Kombination wirkte ähnlich. Kupferoxid hemmte dabei auch nicht den mikrobiellen Abbau von Mefenoxam. Beide Mittel verringerten zwar den Anteil empfindlicher Pilze und scheinen neue Bakteriengemeinschaften zu fördern, jedoch ohne deutlichen additiven Effekt. In vitro untersuchten Zhang et al. (2003) den Einfluss von Kupfersulfat, dem Herbizid Acetochlor und dem Insektizid Methamidophos bzw. deren Kombinationen auf die indigene Mikrobenpopulation im Boden. Ab 62,5 mg Acetochlor/L und 3,75 mg Cu/L hemmten beide Mittel sehr stark. Darunter nahm die Wirkung der Kombination zwar ab, aber es traten teilweise stärkere Effekte auf als bei den Einzelmitteln. Die IC₅₀ lag dann für Acetochlor bei 13,26 mg/l, für Kupfer bei 0,58 mg/L. Auch die Kombination von Methamidophos und Kupfer erhöhte teilweise die Wirkung gegenüber den Einzelmitteln. Die IC₅₀ lag für das Insektizid bei 26,18 und für Kupfer bei 1,54 mg/L.

In vitro-Tests mit nicht bodenbürtigen Mikroorganismen wie Photobacterium phosphoricum (Microtox) und dem Protozoen Colpidium campylum ergaben bei beiden eine starke synergistische Wirkung zwischen Kupfersulfat und den Fungiziden Zineb und Maneb, während die Einzelmittel weniger toxisch waren (Vasseur et al., 1988). Im Microtox-Test begannen die wirksamen Konzentrationen bereits bei 20 µg Cu/L und 9 µg/L bei den beiden Fungiziden, im Protozoentest dagegen erst bei 63 µg Cu/L und 50 µg Zineb/L bzw. 400 µg Maneb/L. Das Insektizid Carbaryl wies dagegen nur bei höheren Konzentrationen (0,2 mg Cu/L, 8 mg Carbaryl/L) geringe Interaktionen mit Kupfer auf. Auch die im Holzschutzbereich verwendete Kombination von Kupfersulfat mit Pentachlorphenol (PCP) wurde mittels Bakterientest (Escherichia coli) untersucht (Zhu et al., 2001). Gegenüber den Einzelmitteln wurde der cytotoxische Effekt durch nicht (5,0 µM Cu) und subtoxische Konzentrationen (0,2 mM PCP) der kombinierten Mittel erhöht. In Bodenextrakten untersuchten Nagler et al. (1997) die Wirkung von Kupfernitrat (200 und 500 µM Cu) und dessen Kombination mit dem Insektizid Parathion (2 mg/L) auf die Testbakterien Bacillus subtilis und Pseudomonas fluorescens. Dabei entsprach die Hemmung der Kombination auf B. subtilis etwa der des Kupfers allein, nämlich etwa 42% bei 200 µM Cu und 93% bei 500 µM Cu. Kungolos et al. (2009) verwendeten in Mikrobiotests neben Daphnia magna und der Alge Pseudokirchneriella subcapitata auch das Bakterium Vibrio fischeri zur Ermittlung der Wirkung von Kupferchlorid-dihydrat und dessen Kombination mit den Pflanzenschutzmitteln Fosthiazat, Metalaxyl-M und Imidacloprid. Kupfer erwies sich dabei mit einer IC₅₀ von 0,18 mg/L als das toxischste Mittel gegenüber V. fischeri bzw. mit 0,05 mg/L gegenüber P. subcapitata; Imidacloprid war dagegen am wenigsten toxisch. Die interaktiven Effekte von Kupfer mit den Mitteln hingen von den Testorganismen, den verwendeten Mitteln und deren Konzentrationen ab: In Kombination mit Fosthiazat wirkte Cu etwas schwächer, mit Metalaxyl-M dagegen teilweise etwas stärker als erwartet gegenüber V. fischeri.

Im Gewächshausversuch testeten Wyszkowska et al. (2007) über 56 Tage u. a. den Einfluss von Kupfer und Nickel (als Chloride) sowie deren Kombinationen auf verschiedene Mikroorganismen in zwei Böden. Die Population von Azotobacter spp. wurde durch beide Schwermetalle (50 mg Cu/kg, 200 mg Ni/kg) gehemmt, wobei diese kombiniert stärker wirkten als einzeln. Andere Mikroorganismengruppen (z. B. Ammonifikanten, N-Immobilisierer, Arthrobacter) reagierten meistens nicht so empfindlich. Ergänzende Gefäßversuche mit weiteren Schwermetallen (Cd, Pb, Zn) in Kombination mit Cu (150 und 450 mg/kg) als Chloride in einem Boden mit und ohne Hafer (Avena sativa) zeigten, dass zwar der Pflanzenbewuchs die Reaktion verschiedener Mikroorganismengruppen (z. B. Arthrobacter, Pseudomonas, zellulolytische Bakterien) gegenüber der Belastung veränderte, doch unterschied sich der Effekt der Einzelmittel kaum von dem ihrer Kombination (Wyszkowska et al., 2008). Ranjard et al. (2006b) fanden im Kurzzeittest bei der Bakteriendiversität im Boden verglichen mit den Einzelmitteln allerdings eine kumulative Wirkung der kombiniert als Chloride angewandten Schwermetalle Cu (50 – 300 mg/kg), Cd (2 – 40 mg/kg) und Hg (2 – 20 mg/kg). Bressan et al. (2008) beobachteten nach der Anwendung „geringer Stressereignisse“ (z. B. durch 50 mg Cu/kg als Chlorid) eine Verringerung der Empfindlichkeit der Bakteriendiversität im Boden gegenüber einem „starken Stress“ durch 100 mg HgCl₂/kg. Auch die Wirkung von Kupfersulfat (10 mg Cu/kg) und dessen Kombination mit anderen Schwermetallsulfaten (Cd, Pb, Sb. Zn) auf die Ektomykorrhiza von Pinus sylvestris wurde untersucht (Hartley et al., 1999). Im Feld mit Kupfer kontaminierter Boden war für diese Mykorrhiza kaum toxisch, während der mit allen Schwermetallen kontaminierte Boden stärker wirkte. Vermutlich kann die Toxizität multipler Schwermetallkontaminationen gegenüber der Ektomykorrhiza nicht aus der individuellen Toxizität der Metalle abgeleitet werden.