Zum Auftreten von Monilia fructicola in Mittelbaden

Occurence of Monilia fructicola in Mittelbaden

Material und Methoden

Abb. 1. Orte der Probenahme. (B) Brombeer-Anlage mit Erstnachweis von Monilia fructicola; (X) Anlage mit Nachweis von M. fructicola; (o) Anlage ohne Nachweis von M. fructicola.

DNA-Extraktion. Von den sporulierenden Monilia-Kul­turen wurden mittels einer sterilen Impfnadel Luftmyzel und Konidienketten entnommen. Daraus wurde mit dem Qiagen (Hilden) Dneasy Plant Mini Kit – nach Anleitung des Herstellers – Gesamt-DNA isoliert. Die DNA wurde entweder sofort in der PCR eingesetzt oder bei –20°C gelagert.

Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Bestimmung der vorliegenden Monilia-Art erfolgte in mindestens einem von drei PCR-Verfahren. Dafür wurde die aus den sporulierenden Monilia-Isolaten extrahierte DNA in der PCR nach Côté et al. (2004), Hughes et al. (2000) bzw. Miessner und Stammler (2010) eingesetzt. Die PCR-Bedingungen, die Konzentrationen der Reagenzien und die Primersequenzen wurden von den jeweiligen Autoren übernommen. Die Primer wurden von Eurofins MWG Operon (Ebersberg) synthetisiert. Die Taq DNA Poly­merase (recombinant) wurde mit den entsprechenden Puffern und dem dNTP Set von Fermentas (St. Leon-Rot) bezogen.

Die Amplifikate wurden in 1,5% Agarose-Gelen elek­trophoretisch aufgetrennt und durch Zugabe von SERVA DNA stain G (SERVA Electrophoresis, Heidelberg) auf einem UV-Tisch fotografisch dokumentiert. Als Größenmarker wurde der GeneRuler^TM 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, St. Leon-Rot) eingesetzt.

Abb. 3. Identifizierung von M. fructicola (Spuren 1, 2, 3), M. laxa (Spuren 5, 6, 7) und M. fructigena (Spuren 8, 9, 10) in PCRs nach Hughes et al. (2000) und anschließender gelelektrophoretischer Auftrennung der Amplifikate. M. fructicola spezifische PCR (Spuren 1, 5, 8), M. fructigena spezifische PCR (Spuren 2, 6, 9), M. laxa spezifische PCR (Spuren 3, 7, 10), 100 bp Marker (Spur 4).

Abb. 4. Elektrophoretische Auftrennung von Amplifikaten von M. fructicola von Brombeere (Spur 3) und Zwetsche (Spuren 5, 6, 9, 10), M. fructigena von Zwetsche (Spuren 2, 7) und M. laxa von Zwetsche (Spuren 1, 8) in der PCR nach Côté et al. (2004). 100 bp-Marker (Spur 4).

Abb. 5. Elektrophoretische Auftrennung von Amplifikaten von M. fructicola (Spuren 2, 3, 4, 6, 8), M. fructigena (Spuren 1, 10) und M. laxa jeweils von Kirsche (Spur 9) in der PCR nach Miessner und Stammler (2010). 100 bp-Marker (Spur 7) und Wasserkontrolle (Spur 5).

Für M. laxa und M. fructigena waren hingegen in den entsprechenden PCR-Verfahren Amplifikate von 280 bp bzw. 460 bp (jeweils mit artspezifischen Primern; Hughes et al., 2000), 350 bp bzw. 402 bp (Côté et al., 2004) sowie 3649 bp bzw. 1412 bp (Miessner und Stammler, 2010) zu finden (Abb. 3 bis 5). Lediglich acht von den 68 sporulierenden Isolaten (12%) wurden nicht als M. fructicola sondern als M. laxa klassifiziert. Damit war die Wahrscheinlichkeit, dass es sich bei den innerhalb von drei bis vier Tagen Inkubationsdauer sporulierenden Monilia-Isolaten um die Art M. fructicola handelte, relativ hoch.

Bei allen Isolaten, bei denen die Artbestimmung mit zwei bzw. drei PCR-Verfahren erfolgte, wurde jeweils dieselbe Monilia-Art identifiziert. Insofern war schon ein PCR-Verfahren für einen sicheren Nachweis, dass es sich um M. fructicola handelt, ausreichend. Nicht geprüft wurde jedoch mittels der PCR-Methoden, ob unter den nicht-sporulierenden Monilia-Isolaten nicht möglicherweise doch atypische Vertreter von M. fructicola vorhanden waren.

Insgesamt wurden von 1483 Früchten aus 121 Anlagen im Umkreis von etwa 2 km um den Ort des Erstauftretens in Baden-Württemberg Monilia-ähnliche Pilze auf PDA isoliert (Tab. 1). Da in dem betreffenden Gebiet (Abb. 1) Kirschen- und Zwetschen-Anlagen dominierten, wurden vor allem Früchte dieser Kulturen beprobt. Von 825 Kirschenfrüchten aus 53 Anlagen wurde von 38 Früchten aus 12 Anlagen M. fructicola isoliert (Tab. 1). Das entspricht einem Befall von etwa 5% der Früchte bzw. 23% der Anlagen. Bei den Zwetschen war hingegen ein geringerer Befallsgrad zu verzeichnen: Hier trat M. fructicola an ca. 3% der Früchte und in etwa 16% der Anlagen auf. Von Pfirsich und den übrigen Fruchtarten aus insgesamt 13 Anlagen wurden 20 Isolierungen vorgenommen. An diesen Kulturen wurde im Rahmen dieser Erhebung kein M. fructicola-Befall festgestellt (Tab. 1).

Für die Untersuchung einer großen Probenanzahl auf einen Befall mit M. fructicola im Rahmen eines Monitorings war es notwendig, ein kostengünstiges, schnelles und zuverlässiges Nachweisverfahren zu entwickeln (Abb. 2). Das Isolieren von Pilzen auf Früchten, die einen sichtbaren Befall mit Monilia aufwiesen, auf ein Nähr­medium konnte relativ rasch durchgeführt werden. So waren Monilia-Isolierungen von etwa 50 bis 60 Früchten je Stunde vorzunehmen. Nach einer Inkubation von drei bis vier Tagen bei 20°C im Dunkeln waren mit einer Lupe bei etwa 15-facher Vergrößerung sehr leicht die schnell wachsenden und im Luftmyzel mit den für Monilia typischen, zitronenförmigen Konidien sporulierenden Isolate zu erkennen. Sie wurden innerhalb von einer Stunde unter etwa 200 Isolierungen identifiziert. Von einigen der sporulierenden Pilze wurde direkt die DNA extrahiert. Ansonsten erfolgten die DNA-Extraktionen von den Reinkulturen. Insofern war es möglich, innerhalb von vier bis fünf Tagen nach Probeneingang im Labor eine eindeutige Diagnose zu stellen.

Abb. 2. Verfahren zum Nachweis von M. fructicola. Isolierung von Monilia spec. von infizierten Früchten auf PDA. Von den auf PDA sporulierenden Isolaten wird die Nukleinsäure extrahiert und eine Bestimmung der Monilia-Art über eine artspezifische PCR und anschließender elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte durchgeführt.

Die meisten M. fructicola-Isolate zeigen im Gegensatz zu den beiden anderen Arten auf PDA ein deutlich schnelleres Wachstum, und sie sporulieren sehr bald und stark nach dem Überimpfen auf dieses Medium (Lane, 2002; Anonym, 2009; Hinrichs-Berger und Müller, 2010). Diese Charakteristika wurden für die Entwicklung des hier vorgestellten Monitoring-Verfahrens (Abb. 2) genutzt, bei dem es darauf ankam, viele Proben in einem angemessenen Zeitraum, möglichst kostengünstig und sicher auf einen Befall mit M. fructicola zu untersuchen. Der Vorteil des Verfahrens ist, dass man mit relativ wenig Aufwand innerhalb weniger Tage über die schnelle Sporulation eine Vorauswahl der Monilia-Isolate treffen konnte, die aufgrund dieses charakteristischen Merkmals mit hoher Wahrscheinlichkeit der Art M. fructicola zuzurechnen waren. Nur mit diesen Isolaten wurde eine Art spezifische PCR durchgeführt. Allerdings besteht das Risiko, dass man atypische M. fructicola-Isolate, die auf PDA deutlich langsamer wachsen und gar nicht oder erst später sporulieren, nicht erfasst. Darüber hinaus wäre dieses Verfahren für eine Bestimmung der Monilia-Art beispielsweise an Grenzeinlassstellen im Rahmen der Pflanzenbeschau zu zeitaufwendig. Hier wären Real-time PCR-Verfahren (Van Brouwershaven et al., 2010) angebracht, bei denen der Befund innerhalb weniger Stunden vorliegt, die aber signifikant höhere Kosten verursachen.

Das Monitoring (Tab. 1) zeigte, dass das Erstauftreten von M. fructicola in Mittelbaden im Jahr 2009 kein Einzelfall war. Im Umfeld der Anlage, in der diese Monilia-Art erstmalig aufgetreten war, wurden bislang 60 weitere Früchte von Kirsche und Zwetsche mit M. fructicola-Befall gefunden, was 4% der Monilia-Symptome zeigenden Früchte entspricht. Eine Konzentration des Auftretens war dabei vor allem im östlichen Umfeld der Brombeeranlage zu verzeichnen. Aber auch in 1 bis 2 km Entfernung war der Schadorganismus noch nachweisbar (Abb. 1). Interessanterweise war trotz mehrfacher, intensiver Beobachtung der Brombeeranlage, in der der erste Befall im Jahr 2009 nachgewiesen wurde, im Jahr 2010 kein Monilia-Befall zu finden. Vermutlich waren im Jahr 2009 der Infektionsdruck aus der Nachbarschaft der Anlage so hoch und/oder die Infektionsbedingungen so günstig, dass die Brombeere, die nicht zu den typischen Wirtspflanzen von M. fructicola gehört, infiziert worden war. Ansonsten konnte sich M. fructicola in der Brombeer-Anlage offensichtlich nicht dauerhaft etablieren.

Nur aufgrund des ungewöhnlichen Auftretens einer Monilia an Brombeerfrüchten ist man in der Region auf das Vorkommen dieser Monilia-Art aufmerksam geworden. Bislang wurden in diesem Befallsgebiet weder ein verstärktes Monilia-Auftreten noch neuartige Symptome oder größere quantitative oder qualitative Verluste beobachtet.

In anderen Regionen Europas (Anonym, 2010) hat man in den meisten Fällen M. fructicola nur durch mehr oder minder intensive Monitorings ermittelt und nicht dadurch, dass sich die Art per se auffällig verhalten hätte. In einem deutschlandweiten Monitoring von Juli bis September 2002, bei dem 383 Proben von Monilia-infizierten Stein- und Kernobstfrüchten untersucht wurden, wurde M. fructicola nicht nachgewiesen (Albert et al., 2004).

Durch die sexuelle Vermehrung, die bei M. fructicola die Regel ist, bei M. laxa und M. fructigena aber gar nicht oder nur sehr sporadisch erfolgt (Batra, 1991), kann sich diese Art vermutlich besser an sich ändernde Umwelt­bedingungen anpassen. Dazu gehört möglicherweise, dass sie etwaige Monilia-Resistenzen in Obstsorten schneller überwindet und deutlich rascher Resistenzen gegenüber Fungiziden entwickelt. In einer Risikoabschätzung für die Staaten der Europäischen Union (Van Leeuwen et al., 2001) wird davon ausgegangen, dass nach einer Etablierung von M. fructicola in Europa nicht mit einem Anstieg von Blüten- und Triebinfektionen zu rechnen ist. Aber die Monilia-bedingten Fruchtinfektionen und Fruchtschäden könnten zunehmen, wobei höhere Vor- und Nachernteverluste vor allem bei Pfirsich und Nektarine zu erwarten wären, weniger bei Zwetschen und Pflaumen.

Da M. fructicola visuell nicht von den anderen an Kern- und Steinobst vorkommenden Monilia-Arten zu unterscheiden ist und diese Art gute Möglichkeiten hat, sich in verschiedenen Regionen Europas zu etablieren (Van Leeuwen et al., 2001; Anonym, 2009), wird die weitere Ausbreitung innerhalb Europas nicht aufzuhalten sein. So wurde der Erreger in den letzten Jahren außerhalb Frankreichs in Italien (Pellegrino et al., 2009), Österreich und der Schweiz (Patocchi et al., 2009) nachge­wiesen. Aufgrund der nicht zu unterbindenden Aus­breitung und weil in Regionen wie Nord- und Süd­amerika sowie Ozeanien, in denen dieser Schaderreger schon seit langer Zeit heimisch ist, nach wie vor erfolgreich Kern- und Steinobst produziert werden, ist zu überlegen, ob der Status von M. fructicola auf der EPPO A2 Liste und im Anhang I A I der Richtlinie 2000/29/EG noch gerechtfertigt ist. In jedem Fall sollte man Unter­suchungen zu Infektionen und Verlusten an Kern- und Steinobst durch diesen Schaderreger im Vergleich zu den anderen beiden Monilia-Arten unter den hiesigen Anbaubedingungen durchführen. Mit einem europaweiten Monitoring sollte man sich darüber hinaus einen Überblick über die aktuelle Verbreitung dieses Schaderregers verschaffen.