Vergleich unterschiedlicher Nahinfrarot-Spektrometer und Probenpräsentationen für die Schätzung des Protein- und Stärkegehaltes im Getreidekorn während der Versuchsernte

Comparison of different near infrared spectrometers and sample presentations to estimate the protein and starch content in cereal grains during trial harvest

2 Material und Methoden

Beim so genannten Bandmodul, wie es auf den Mähdreschern der Firma J. Haldrup/Dänemark (Ino-Group) und in baugleichen Feldrandstationen verwendet wird, werden die Körner auf einem Förderband unter dem Spektrometermesskopf hindurchgeführt. Beim Trichtermodul (Durchflusszelle), wie es z.B. auf den Mähdreschern der Wintersteiger AG/Österreich verwendet wird, ist der Messkopf des Spektrometers an der Wandung der Durchflusszelle so angebaut, dass der vorbeifließende Gutstrom durch ein Glasfenster hindurch gemessen werden kann (Abb. 1).

Abb. 1. Versuchsaufbau im Technikum für die Vergleichsmessungen am Band- bzw. Trichtermodul.

Mit dem Corona 45 NIR bzw. Corona Remote NIR kamen zwei Varianten eines verbreiteten Spektrometers der Carl Zeiss Jena GmbH zum Einsatz. Bei dem Corona 45 NIR bildet der Messkopf mit dem Gerät eine konstruktive Einheit, währenddessen bei der Remote-Variante der Messkopf separat über einen Lichtleiter mit dem Gerät gekoppelt ist. Außerdem wurden zwei Spektrometer der Polytec GmbH, Waldbronn ausgewählt, die sich im Wellenlängenbereich unterscheiden.

Für den Vergleich der Spektrometersysteme kam das Bandmodul 1 sowie das Trichtermodul zum Einsatz (Tab. 1, Abb. 1). Mit diesen beiden Modulen wurden sowohl die Inhaltsstoffe (Kap. 3.1) als auch der Einfluss von Verunreinigungen untersucht (Kap. 3.2). Der Gerätevergleich (Kap. 3.3) erfolgte mit zwei hintereinandergeschalteten, baugleichen Bandmodulen 1 und 2, die mit unterschiedlichen Spektrometern bestückt waren (Tab. 1, Abb. 2).

Abb. 2. Versuchsaufbau im Technikum für den Spektrometervergleich am Bandmodul.

Beim Trichtermodul wurden beide Messköpfe am Trichter so montiert (Abb. 1), dass der Abstand zwischen der Glasscheibe des Modulfensters und der Messkopfglasscheibe sehr gering aber groß genug war, das keine Newtonschen Ringe entstehen konnten. Aufgrund der teilweise geringen Probenmengen, die von den Züchtern zur Verfügung gestellt werden konnten, war es erforderlich, den Trichter durch einen Einbau so zu verändern, dass die kontinuierliche Zuführung der Körner über einen „längeren“ Zeitraum möglich war. Dies wurde durch den Einbau einer schräg gestellten Platte erreicht, die zusätzlich mit einem Schieber versehen war, mit dem die verbleibende Öffnung des verkleinerten Trichters bis zum Start der Messung verschlossen werden konnte. Im Gegen­satz zum Bandmodul erfolgt hier die Messung des Gutes an „bewegtem“ Material, das heißt, die Körner bewegen sich beim Passieren der Messeinrichtung gegeneinander. Um diesen Effekt auf seine eventuelle Wirkung auf die Kalibrierqualität zu erfassen, wurde das Gut auch in angestauter Form gemessen. Dafür wurde zusätzlich eine kastenförmige Klappe eingebaut, mit der das zu messende Gut vor den beiden Messköpfen angestaut werden konnte.

Die Referenzwerte für die Inhaltstoffe der Proben wurden bei den Züchtungsunternehmen mittels Labor-NIRS bestimmt.

Soweit erforderlich, wurden die gelieferten Kornproben nachgetrocknet, um die Lagerfähigkeit sicherzustellen. Bis zur Messung wurden sie dann in einem Raum gelagert, der nur geringe Temperaturschwankungen aufwies. Durch die Lagerung unter gleichen Bedingungen wurden die Proben equilibriert, so dass innerhalb einer Art die Unterschiede in der Kornfeuchte gering waren. Einige Stunden vor der Messung wurden die Proben in den Messraum gebracht, um sie an die Raumtemperatur anzupassen und damit weitestgehend gleiche Messbedingungen zu erzielen. Die Trockensubstanzgehalte wurden, in Anlehnung an internationale Prüfvorschriften, am jeweiligen Messtag mit einer Doppelbestimmung an fünf Proben je Art, 24 h Trocknung bei 105°C, überprüft (Internationale Vereinigung zur Prüfung von Saatgut, 1999). Die Auswahl dieser Proben erfolgte über das Programm SL Utilities des CWS (siehe Kap. 2.4) auf Basis der gemessenen Spektren (Subsetroutine).

Die Spektrometer wurden zu Beginn und während einer Messreihe mehrmals nach Herstellerangaben referenziert, um die Gerätedrift zu begrenzen. Gemessen wurde nach Kulturarten getrennt in Gruppen von ca. 80 bis 160 Mustern je Messtag. Nach Möglichkeit wurden diese Gruppen am gleichen Tag bzw. an aufeinander­folgenden Tagen auf dem Band- und dem Trichtermodul mit allen sechs Systemen gemessen. Beim Trichtermodul erfolgte die Messung mit beiden Spektrometersystemen zunächst im Durchfluss und mit der gleichen Probe unmittelbar danach angestaut. Beim Gerätevergleich wurden die Proben je Versuchsjahre an einem Tag mit zwei hintereinander angeordneten Bandmodulen gemessen.

Der Datenimport in die Chemometriesoftware CWS (Calibration Work Shop; SensoLogic GmbH, Norderstedt), mit dem auch die Kalibration und Validation durchgeführt wurde, erfolgte über den CWS-Programmteil SL Utilities.

Datensätze: Die Kalibrationen der genannten Inhaltsstoffe wurden für die einzelnen Getreidearten, Spektrometer und Probenpräsentationen getrennt erstellt. Die Kulturart Gerste wurde nochmals in Sommer- und Wintergerste unterteilt, da es sich nach verschiedenen Diversitätsstudien um getrennte Genpools handelt (Malysheva-Otto et al., 2006; Haseneyer et al., 2010). Parzellenwiederholungen wurden nicht berücksichtigt, da sie statistisch nicht unabhängig sind, zu höheren Freiheitsgraden führen und in der Folge einen geringeren Fehler vortäuschen.

Datenvorbereitung: Die Auswertung der in diffuser Reflexion gemessenen Spektren erfolgte auf der Basis von Absorptionsspektren. Der Spektren-Offset-Effekt infolge der Schüttdichteunterschiede wurde durch die erste Ableitung der Spektren kompensiert.

Kalibration und Validation: Die Kalibriermodelle wurden mit der Methode Partial Least Squares Regression (PLSR) berechnet. Die Datensätze wurden dafür in jeweils einen Kalibrier- und Validierdatensatz im Verhältnis 70/30 aufgeteilt. Die Zuordnung der Proben zu diesen Datensätzen erfolgte durch Zufallsauswahl mit dem Programmteil SL Utilities des CWS, um die Unabhängigkeit des Validationsdatensatzes zu gewährleisten.

Für die Ausreißerdiagnose wurden die programminternen Optionen des CWS auf folgende Limits gesetzt: globaler H-Wert > 3; T-Wert (Student’s t-test) > 3; D-Wert (Cook’s statistic) > 3 und S-Wert (Spektren-Rekonstruktions-Fehler) > 5. Die Größe des Kreuzvalidationssets wurde auf 10% des Kalibrierdatensatzes festgelegt.

Die Beurteilung der Kalibrierergebnisse erfolgte mit den üblichen Fehlermaßen der Kalibrationsstatistik, dem RMSECV (Root-mean-square error of cross-validation; gemittelter Standardfehler der Kreuzvalidation) und dem RMSEP (Root-mean-square error of prediction; Standardfehler der Vorhersage bei Validation an einem externen Testset). Zusätzlich wurde der RPD-Wert (ratio of standard deviation of the reference data set for the validation samples) als dimensionslose Größe zur Beurteilung herangezogen. Der RPD-Wert beschreibt das Verhältnis zwischen der Standardabweichung des Merkmals im Validationsset (SD_val) und dem Standardfehler der Vorhersage (SEP) und ist wegen seiner Dimensionslosigkeit geeignet, unterschiedliche Kalibriermodelle miteinander zu vergleichen.

Voraussetzung ist die Normalverteilung des Validationsdatensets. Die dabei verwendete Beurteilungsskala folgt dem Vorschlag von Williams and Sobering (1996). RPD-Werte < 2 werden als nicht ausreichend für eine gute Kali­bration eingestuft. Werte zwischen 2 und 3 reichen für ein Screening aus. RPD-Werte zwischen 3 und 5 bzw. 5 und 10 stufen die Kalibration als zufriedenstellend bzw. gut bis sehr gut, über 10 als exzellent ein. Außerdem ist das Bestimmtheitsmaß (R²) der Kreuzvalidierung bzw. der externen Validierung dargestellt, das aber nach Plesch (1982) für die Bewertung der Vorhersageleistung mehr orientierenden Charakter hat.

3 Ergebnisse und Diskussion

Daher wurde auf die Einzeldarstellung der Ergebnisse mit der Spektrentransformation „Absorption“ sowie auf die Ergebnisse der angestauten Variante verzichtet.

3.1.1 Sommergerste. Für den Vergleich der Spektrometersysteme wurden Proben von einem Standort aus zwei Erntejahren für die Kalibration verwendet (Tab. 2). Bei den untersuchten Merkmalen Stärke- und Proteingehalt konnten nur für den Proteingehalt befriedigende Ergebnisse erzielt werden (Tab. 4). Für Protein wurden die besten Ergebnisse auf dem Bandmodul mit RPD-Werten über 3 ermittelt, wobei das Spektrometer PSS-1720 tendenziell bessere Modellvoraussagen lieferte als das Corona. Beim Trichtermodul wurden mit beiden Spektrometern gleichwertige Ergebnisse erzielt, die für ein Screening, gemessen an den erreichten RPD-Werten, ausreichen.

Der Fehler (RMSEP) zur Bestimmung des Proteingehalts war beim Bandmodul am geringsten und lag für das Trichtermodell bei der Durchflussmessung nur wenig höher, im Gegensatz zur angestauten Messung, die einen doppelt so hohen Fehler aufweist.

Bei institutsinternen Proteinkalibrationen an getrockneten, vermahlenen Sommergersteproben, gemessen mit dem NIRSystems 6500 (FOSS NIRSystems, USA), wurde in der Kreuzvalidation ein Fehler (RMSECV) von 0,84% ermittelt, allerdings für die etwas größere Merkmalsspann­weite von 7,5 bis 24,1%. Daraus lässt sich ableiten, dass mit den untersuchten Spektrometersystemen an ganzen Körnern praxisnutzbare Ergebnisse erzielbar sind.

3.1.2 Wintergerste. Bei Wintergerste standen Proben von zwei Orten aus zwei Versuchsjahren für die Kalibrierung zur Verfügung (Tab. 2). Im Gegensatz zur Sommergerste konnten für Stärke- und Protein RPD-Werte über 2 ermittelt werden, wobei die Bestimmtheitsmaße und RPD-Werte beim Protein generell höher lagen (Tab. 5).

Die Kalibrationen mit den geringsten Fehlern wurden auch hier mit dem Bandmodul erreicht. Mit einem RMSEP von 0,29 ermittelten Williams and Sobering (1993) bei Labormessungen an ganzen Gerstekörnern einen vergleichbaren Wert, was auch in diesem Fall die praktische Nutzbarkeit der Messungen mit dem Bandmodul bestätigt.

3.1.3 Winterweizen. Für die Kalibrierexperimente konnte auf Proben aus zwei Erntejahren zurückgegriffen werden, die von drei Versuchsorten stammten (Tab. 2).

Für Stärke und für Protein konnten mit dem Bandmodul mit beiden eingesetzten Spektrometern zufriedenstellende Ergebnisse erreicht werden (Tab. 6). Die Bestimmtheitsmaße unterscheiden sich nur wenig. In der Validation wurde für beide Merkmale RPD-Werte ermittelt, die für ein Screening ausreichend sind.

Mit dem Trichtermodul wurden im Durchfluss etwas schlechtere Ergebnisse erzielt als mit dem Bandmodul. Der Fehler für die Proteinschätzung liegt beim Bandmodul und Trichtermodul unter 0,36%. Für den Proteingehalt von Weizen ermittelten Sinnaeve (2004) mit einem Zeiss Corona 45 im Durchfluss mit einem Fehler in der Kreuzvalidation (RMSECV) von 0,27% einen vergleichbaren Wert. Long et al. (2008) erzielten über Transmissionsmessungen mit zwei Spektrometersystemen, die online Situationen mit bewegtem Kornmaterial simulierten, einen RMSEP von 0,31 bzw. 0,45%. Williams and Sobering (1993) erreichten bei Reflektionsmessungen im Labor an verschiedene Weizenformen Fehler für die Proteinschätzung (RMSEP) zwischen 0,16 und 0,25% und damit im Vergleich zu den vorgestellten Ergebnissen am Band nur tendenziell bessere Werte.

Die Kalibrationsmodelle für das Spektrometersystem PSS-1720/Bandmodul lieferten im Vergleich zum System Corona 45 NIR/Bandmodul tendenziell bessere Bestimmtheitsmaße und RPD-Werte, sowohl für Stärke als auch für Protein.

3.1.4 Triticale. Triticaleproben wurden nur von einem Standort bereitgestellt. Hier konnten für die Kalibration Proben aus zwei Versuchsjahren berücksichtigt werden (Tab. 2).

Wie bei der Sommergerste konnten auch bei Triticale zufriedenstellende RPD-Werte nur für den Proteingehalt gefunden werden (Tab. 7). Auch bei dieser Kulturart wurden die besten Ergebnisse mit dem Bandmodul ermittelt, wobei das Spektrometer PSS-1720 hier deutlich besser abschnitt. Ein sehr hohes Bestimmtheitsmaß für die Validation konnte mit dem PSS-1720 am Bandmodul erreicht werden.

Für ein Screening ausreichende RPD-Werte für die Proteinschätzung wurden auch mit dem Trichtermodul im Durchfluss erreicht. Diese Ergebnisse wurden mit vergleichsweise geringen Probenzahlen ermittelt. Da nur Proben von einem Ort für die Kalibrierung zur Verfügung standen, ist die Extrapolation auf mehrere Orte nicht untermauert. Es kann aber davon ausgegangen werden, dass sich die Kalibration unter Einbeziehung einer größeren Variabilität im Merkmal Proteingehalt entsprechend verbessert. Der RMSEP war beim Proteingehalt sowohl beim Band- wie auch beim Trichtermodul gering, stieg aber von der Bandpräsentation zur Trichterpräsentation an.

Aufgrund der in den Materialgruppen „gereinigt“ bzw. „ungereinigt“ unterschiedlichen Anzahl an Jahren und Orten, die in die jeweilige Kalibration eingingen, können die Ergebnisse (Tab. 8) nur der Größenordnung nach verglichen werden. Für den Stärkegehalt wurde ein etwas höherer Fehler für die gereinigte Variante ermittelt. Dies scheint paradox, ist aber durch die Berücksichtigung des zweiten Versuchsortes begründet, der eine höhere Standardabweichung in der Stärke aufweist. Bei der Valida­tion wurden deutlich bessere RPD-Werte für die gereinigte Variante ermittelt. In der nicht dargestellten, angestauten Variante war der Fehler deutlich größer, was darauf hindeutet, dass durch die Erfassung einer größeren Mess­fläche, das heißt größeren Materialmenge, der durch die Verunreinigung bedingte Fehler verringert wird.

Beim Proteingehalt unterschieden sich die Fehler und Bestimmtheitsmaße der Kalibration in der Regel nur wenig voneinander. Bei den System-Kombinationen mit dem PSS-1720-Messkopf werden im Vergleich zu den Kombinationen mit dem Corona-Messkopf jedoch die höheren RPD-Werte ermittelt.

Zur eingehenderen Überprüfung des Reinigungseffektes wurde ein Probensatz der Wintergerste aus dem Ernte­jahr 2009 verwendet, von dem gereinigte und ungereinigte Muster der gleichen Stichprobe zur Verfügung standen. Dazu wurde mit dem PSS-1720 und dem Bandmodul das Spektrometersystem mit dem höchsten RPD-Wert aus dem Gesamtvergleich herangezogen (Tab. 5). Durch die einheitliche Begrenzung der PLS-Faktoren auf 10, können die Fehler direkt verglichen werden.

Die Kalibrationsergebnisse der Probenpräsentation mit dem System PSS-1720 und Bandmodul zeigen, dass die Fehlervarianz der Proben sowohl beim Stärke- als auch beim Proteingehalt durch die Verunreinigung nur wenig erhöht war (Tab. 9). Bei der gemeinsamen Kalibration der gereinigten und ungereinigten Proben lag der Fehler für den Proteingehalt etwas höher, insgesamt nahm der Fehler durch die Verunreinigung jedoch nicht so stark zu, wie man das möglicherweise erwartet hätte. In der Validation wurde für den Stärkegehalt im Gegensatz zum Proteingehalt kein für ein Screening ausreichender RPD-Wert erreicht.

Bei den Zeiss Spektrometern zeigt sich, dass sich mit beiden Bandmodulen in der Regel vergleichbare Ergebnisse erzielen lassen. Leichte Abweichungen können durch die Größe des Kreuzvalidationssets bedingt sein, da nicht mit der Leave-One-Out-Methode (Davies, 1998) gearbeitet wurde.

Die beiden Geräte von Polytec liefern ebenfalls vergleichbare Ergebnisse. Durch die einheitliche Festlegung der PLS-Faktoren auf 5 lassen sich die Fehler (RMSECV) der Kreuzvalidation direkt vergleichen. Hier liegt der Fehler beim PSS-2120-Spektrometer häufig etwas über dem des PSS-1720.

Nur beim Stärkegehalt von Winterweizen ist ein deutlicher Jahreseffekt mit einem fast doppelt so hohen Fehler 2009 im Vergleich zu 2008 zu erkennen (Tab. 10). Der Jahreseffekt kann entweder an Unterschieden im Stärkeaufbau oder Differenzen in den gelieferten NIR/NIT-Referenzdaten liegen. Bei Triticale bestätigte sich dieser Jahreseffekt nicht, weshalb hier nur die gemeinsame Kalibration beider Jahre dargestellt ist (Tab. 11). Es liegt die Vermutung nahe, dass die Abweichungen bei Weizen in den Referenzdaten begründet sind, da im Gegensatz zu Triticale die Weizenproben aus verschiedenen Unternehmen stammten. Beim Proteingehalt konnte dieser Effekt nicht gefunden werden.

Bei der Wintergerste wurde aufgrund der niedrigen Probenzahl mit dem Proteingehalt nur das besser zu kalibrierende Merkmal für den Vergleich berücksichtigt. Auch bei der Gerste bestätigt sich, dass mit den Geräten beider Firmen vergleichbare Ergebnisse zu erzielen sind (Tab. 12).

Dass mit dem PSS-1720 die besseren Ergebnisse zu erzielen sind, kann in der Tendenz für alle untersuchten Getreidearten bestätigt werden, da der Fehler bei diesem Gerät in der Regel am niedrigsten war. Die Unterschiede zu den anderen Spektrometern waren jedoch nicht sehr groß. Der Vergleich der beiden Polytec Spektrometer bestätigt Laborergebnisse von Williams and Sobering (1993), dass der Wellenlängenbereich über 1800 nm für die Stärke- und Proteinbestimmung an ganzen Körnern keinen Vorteil bringt.

Für züchterische Zwecke eignet sich demnach, insbesondere bei kleinen Probenmengen, das Spektrometersystem aus PSS-1720 und Bandmodul am besten. Der leichte Vorteil der Kalibrationsergebnisse des PSS-1720 gegenüber dem CORONA 45 NIR könnte in der kollimierten Messgeometrie des PSS-H-A01-Messkopfes begründet sein, die das System relativ unempfindlich gegenüber wechselnden Oberflächeneigenschaften des zu messenden Gutes macht.

Im Vergleich zu den anderen Getreidearten scheint bei Winterweizen die Stärke besser kalibrierbar zu sein, was seine Ursache im höheren HL-Gewicht und der besseren Fließfähigkeit haben könnte. Wie der Vergleich der Kalibrationsparameter von NIRS-Messung im Labor mit der NIRS-Messung ganzer Körner am Beispiel des Winterweizens zeigt, ist bei geeigneter Wahl des Spektrometersystems eine Vermahlung der Körner nicht zwingend erforderlich.

Entscheidend für die Zuverlässigkeit der Kalibrationen ist der Methodenfehler der Referenzanalytik. Isengard et al. (2010) weisen darauf hin, dass eine Kalibration mit guten statistischen Parametern noch keine Garantie für eine korrekte Messung ist. Dass die NIRS-Schätzungen nur so gut wie die Labormethode sein können, spiegelt sich in den im Vergleich zum Proteingehalt niedrigeren RPD-Werten für die Stärkegehaltsbestimmung wieder, da die Genauigkeit der Stärkebestimmung im Labor immer noch zu wünschen übrig lässt.

Der verwendete Prototyp des Polytec-Messkopfes, der am Trichtermodul zum Einsatz kam, wurde inzwischen vom Hersteller zu einem robusten, kompakten und selbstreferenzierenden Kontaktmesskopf (PSS-H-B01) weiterentwickelt, der statt der drei Lichtquellen á 5 W mit einer 20 W Lampe ausgestattet ist. Von der Firma Zeiss ist mit dem Corona Plus 45 NIR ein ebenfalls selbstreferenzierendes Gerät auf den Markt gekommen, das mit einer Saphirscheibe ausgestattet ist und als Kontaktmesskopf genutzt werden kann. Die zweite Glasscheibe, die beim Trichtermodul in der vorliegenden Studie verwendet wurde, kann deshalb hier entfallen. Inwieweit beide Entwicklungen bessere Ergebnisse liefern, wäre Gegenstand weiterer Untersuchungen.

Das Vorhaben 15439 N/1 der Gemeinschaft zur Förderung der privaten deutschen Pflanzenzüchtung e.V. (GFP), Bonn, wurde über die Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen „Otto von Guericke“ (AiF) im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung und -entwicklung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.