Vorkommen des Soil-borne wheat mosaic virus (SBWMV-NY) in Schleswig-Holstein und dessen Bedeutung für den Weizenanbau

Occurrence of Soil-borne wheat mosaic virus (SBWMV-NY) in Schleswig-Holstein and its importance for wheat cultivation

Material und Methoden

Der elektronenmikroskopische Nachweis von Viruspartikel des SBWMV-NY im Blattsaft infizierter Feldpflanzen der Sorte Primus erfolgte sowohl mittels Immunelektronenmikroskopie (ISEM-Technik) durch Dekoration der Partikel unter Einsatz des gereinigten mAK 4G4 als auch mittels Immunogold-Markierungen unter Verwendung des mAK 4G4. Die Präparate wurden jeweils mit 2% Uranylacetat kontrastiert. Der molekularbiologische Nachweis der Furoviren fand durch RT-PCR wie folgt statt: Gesamt-RNA wurde unter Nutzung des Minikits Bio&SELL RNA Tri-Flüssig isoliert und die cDNA synthetisiert. Die RT-PCR verlief nach einem Standardprotokoll (3 min bei 96°C, 35 Zyklen mit 30 s bei 96°C, 75 s 56°C, 60 s bei 72°C und mit einer abschließenden Extension von 10 min bei 72°C) unter Verwendung virusspezifischer Primer für das SBWMV (PGRV4a-5’CTGCGACTCACGCTTACATA3‘, PGRV
4b-5’TAACCGCTTTGGGATGATAG3‘) mit einem PCR-Pro­dukt von 680 bp und für das SBCMV (SBCMVfor_RNA2-
5’ACTTACCCATTTAGGTGTAA3‘, SBCMVrev_RNA2-5’TTATAATCACGCAAGTACCT3‘) mit einem PCR-Produkt von 978 bp (Fomitcheva et al., 2008).

Außerdem erfolgte das Screening genomischer DNA des geprüften Weizenmaterials zur Identifizierung diagnostischer Marker (153 bp- oder 155 bp-Allele) im Bereich des Sbm1-Gens mit dem Mikrosatellitenmarker Xgwm469-5D. Die genomische DNA wurde mittels CTAB-Methode (Graner et al., 1991) isoliert. Eine zusätzliche Extraktion mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) wurde vor der Ethanolfällung vorgenommen. Die PCR wurde in einem AB9700 Thermal Cycler (Applied Biosystems) mit Fluores­zenz-markiertem Cy5 Vorwärts- und unmarkiertem Rück­wärts-Mikrosatellitenprimern durchgeführt. Die Analyse der PCR-Produkte erfolgte mit dem CEQTM 8000 Genetic Analysis System (Perovic et al., 2009a).

Ergebnisse

Abb. 1. Verbreitung des Soil-borne wheat mosaic virus Stamm New York (SBWMV-NY) in Schleswig-Holstein (Image © 2012 Geo Content, Google Earth).

Die Identifizierung des SBWMV erfolgte weiterhin durch spezifische Markierung der Viruspartikel aus infizierten Blättern von Feldpflanzen der Sorte Primus. Die elektronenmikroskopische Darstellung der stäbchenförmigen Partikel mit Zentralkanal zeigte die Existenz von zwei Partikellängen. In den Blattsaftpräparaten wurden Virionen im Längenbereich von 125 nm bis 175 nm und von 200 nm bis 340 nm beobachtet (Abb. 2A). Zum Nachweis der Identität der Partikel mit dem SBWMV wurde eine Partikeldekoration mit dem spezifischen mAK 4G4 vorgenommen (Abb. 2B) und eine Immunogold-Markierung durchgeführt (Abb. 2C).

Abb. 2. Elektronenmikroskopische Darstellung von stäbchenförmigen Partikeln mit Zentralkanal des SBWMV-NY aus infizierten Blättern von Feldpflanzen der Weizensorte Primus A – undekorierte Partikel in zwei Längenbereichen, B – mAK 4G4 dekorierte SBWMV Partikel, C – Immunogold-Markierung mit mAK 4G4.

Im Ergebniss dieser Untersuchungen wurden eindeutig spezifisch markierte Viruspartikel des SBWMV identifiziert.

Diese Befunde wiesen für Deutschland eine zweite Region der Verbreitung dieses Furovirus aus. Im Jahr 2002 wurde in Baden-Württemberg am Standort Heddesheim das erste Mal ein Furovirus mit hoher Aggressivität an Winterweizen beobachtet (Koenig und Huth, 2003), welches als Nebraska-Stamm identifiziert wurde.

Die SBWMV-Isolate aus den Befallsregionen von Schleswig-Holstein wurden vergleichenden Sequenzanalysen unterzogen und konnten dem NY-Stamm des SBWMV zugeordnet werden (Ziegler et al., 2012).

Mitte Mai 2012 wurden sechs Weizenschläge in der Region um Cashagen (Tab. 3) besichtigt, um den Umfangs des Virusbefalls und dessen Einfluss auf den Weizenanbau in dieser Region bewerten zu können. Wie aus Tab. 3 ersichtlich ist, etablierten sich die Pathogenpopulationen aus pilzlichem Vektor (P. graminis) und dem SBWMV-NY sowohl in den nährstoffreichen Mineralböden mit hoher organischer Humusmasse (Mutterboden, anmooriger Boden) als auch in den leichteren Mineralböden (Schwemmboden, sandiger Lehm).

Das SBWMV-NY erreichte in den Feldpflanzen der anfälligen Sorten hohe Virustiter. Nur am Standort Goldher-Hehlsen I, wo die Sorte Farandole angebaut wurde, konnte in diesem Jahr kein Virusbefall nachgewiesen werden. RT-PCR-Analysen bestätigten diese Ergebnisse (Abb. 3). Das SBCMV wurde in den Pflanzen dieser viruskontaminierten Felder nicht nachgewiesen.

Abb. 3. RT-PCR-Nachweis des SBWMV-NY (Fragmentgröße 680 bp) in verschiedenen Winterweizensorten unterschiedlicher Weizenschläge in Umgebung von Cashagen im Jahr 2012 (1–6: Weizenschläge (s. Tab. 3), 7: positive Viruskontrolle, 8: negative PCR-Kontrolle, M: Molekülmassemarker (GeneRuler, 1 kb, Fermentas).

In vier der besichtigten Felder existierten entlang der Bearbeitungsrichtung bereits größere Infektionsherde (Abb. 4A). In diesen Schlägen zeigten die Weizensorten Primus, Kredo und Diskus starke Virussymptome. Im Vergleich zu den symptomlosen Pflanzen war die Wuchshöhe infizierter Pflanzen Mitte Mai bereits um ca. 50% reduziert (Abb. 4B). Virus befallene Pflanzen hatten kaum noch symptomfreie Blätter (Abb. 4C) und oft nur einen oder zwei Bestockungstriebe (Abb. 4D).

Abb. 4. Infektion der Sorte Primus durch SBWMV-NY im Winterweizenschlag Bormkoppel A – Infektionsherd im Feld, B – Wuchsdepressionen infizierter Pflanzen im Vergleich zu gesunden Pflanzen, C – Strichel-Mosaiksymp­tome an Primus, D – geringe Bestockung.

Unsere Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Weizenproduktion in diesen Regionen vom Anbau SBWMV-resistenter Sorten profitieren kann.

Abb. 5. Vergleich der Resistenzreaktionen von anfälligen und resistenten Weizensorten und der anfälligen Gersten-Landrasse (G) gegen das SBWMV-NY nach Kultivierung in infektiöser Erde des Schlages Bormkoppel unter Gewächshausbedingungen im Zeitraum von 3 bis 10 wpi, Wu – Wurzel-, Sp – Spross-, Bl – Blattinfektion.

Weitere Weizensorten und -linien zeigten eine deutliche Resistenzdifferenzierung (Abb. 6). Die Linie Cltr17886, die Sorten Rene Leblond, Hyland, Hybery und Plutos und die DH-Linie WW Gi 03-27 wiesen bis 8 wpi nur geringe Virustiter in den Wurzeln auf. In der darauf folgenden Inkubationszeit erfolgte keine Virusausbreitung in Spross und Blätter. In diesen Weizenformen liegt offensichtlich eine Translokations(Ausbreitungs)-Resistenz gegen das Virus vor, deren genetischer Hintergrund noch unbekannt ist (Hariri et al., 1987; Myers et al., 1993; Huth et al., 2007; Lyons et al., 2008). In den anfälligen Weizensorten hingegen wurde ab 5 wpi Virusbefall mit mittleren und hohen Virustitern auch in Spross und Blättern nachgewiesen.

Abb. 6. Prüfung der Resistenz von zugelassenen Weizensorten und Resistenzträgern gegen das SBWMV-NY in infektiöser Erde unter Gewächshausbedingungen im Zeitraum von 3 bis 8 Wochen nach Aussaat (wpi) Wu – Wurzel-, Sp – Spross-, Bl – Blattinfektion; 1 Cltr 17886; 2 Rene Leblond; 3 Plutos; 4 WW Gi 03-27; 5 Hyland; 6 Hybery; 7 Akteur; 8 Ritmo; 9 Tuareg; 10 Inspiration; 11 Potenzial; 12 Tobak; 13 Julius VSS.

Das Material wurde einer Analyse zur Identifizierung des Resistenzgen-Locus Sbm1, der mit der Furovirusresistenz in Weizen korreliert (Kanyuka et al., 2004; Bass et al., 2006; Perovic et al., 2009b), unterzogen. Dieses Resistenzgen wurde auf dem Chromosom 5 des D-Genoms im hexaploiden Weizen kartiert und wird monogen vererbt. Es kann durch den Mikrosatellitenmarker Xgwm469-5D nachgewiesen werden. In resistenten Genotypen weist der Xgwm469-5D-Marker ein 153 bp- oder ein 155 bp-Allel nach und in anfälligen Weizen ein Null-Allel in diesen Positionen.

In der Tab. 4 wurden die Ergebnisse zur Identifizierung diagnostischer Marker den Extinktionswerten (E_{405 nm}) nach achtwöchiger Inkubationszeit gegenüber gestellt.

Die Resistenzreaktionen dieser Weizensorten stimmten mit den Ergebnissen des Nachweises der diagnostischen Marker sehr gut überein.

Die Resistenzprüfungen in den zugelassenen Weizensorten zeigten, dass resistente Sorten (Farandole, Hyland, Hybery, Mirage und Carenius) vorhanden sind, welche in Befallsflächen Schleswig-Holsteins die Weizenproduk­tion sichern können. Andere Resistenzquellen sind Linienmaterial und die in der Zulassung befindliche Sorte Plutos.

Unsere Beobachtungen und neueste Berichte aus Polen (Trzmiel et al., 2012) belegen, dass das SBWMV in Europa weiter verbreitet ist, als bisher bekannt war. Die polnischen Autoren wiesen in der Region Westpolens (süd­liches Wielkopolska) in Triticalepflanzen das SBWMV-Nebraska nach (Abb. 7).

Abb. 7. Verbreitung des Nebraska-(grüne Dreiecke) und des New York-Stammes (gelbe Dreiecke) des SBWMV in Europa (Image © 2012 Geo Content, Google Earth).

Um epidemiologische Studien zur Verbreitung unterschiedlicher Stämme des SBWMV durchführen zu können, sollte das Vorkommen dieses Virus in Europa detailliert untersucht werden.

Die Resistenzzüchtung gegen Furoviren ist für die verschiedenen Getreidearten unterschiedlich entwickelt. Für den Weizen als ökonomisch bedeutsamste Art wurden weltweit Resistenzquellen gegen bodenbürtige Viren evaluiert (Modawi et al., 1982; Merkle und Smith, 1983; Cox et al., 1994; Barbosa et al., 2001; Bayles und Napier, 2002), Resistenzloci in den D- und B-Genomen kartiert und erste diagnostische Marker für Allele, die mit der Virus­resistenz korrelieren, entwickelt (Bass et al., 2006; Perovic et al., 2009b; Maccaferri et al., 2011). Es wurden auf dem langen Arm von Chromosom 5 des D-Genoms und auf dem kurzen Arm des Chromosom 2 des B-Genoms Resistenzgene lokalisiert, die durch spezifische diag­nostische Marker im Zuchtmaterial von Weich- (Triticum aestivum) und Hartweizen (Triticum durum) identifiziert werden können. Wie unsere Untersuchungen zur Sortenresistenz gegen das SBWMV-NY zeigen, gibt es auch in Deutschland zugelassene Winterweizensorten (Farandole, Hyland, Hybery, Mirage, Carenius) mit Resistenz gegen Furoviren.

Die in Europa im Anbau befindlichen Roggen- und Triticalesorten sind jedoch sehr anfällig für Furoviren (Kastirr et al., 2002, 2005). Im Anatolischen Genpool des Roggens konnten Resistenzquellen gegen bodenbürtige Viren nachgewiesen werden. Nach Individualauslese aus Pärchenkreuzungen erfolgte die Selektion von Vollgeschwister­familien mit erhöhtem Resistenzniveau. Einige Resistenz-Donoren wurden in Elite-Zuchtmaterial eingekreuzt und dienen der Entwicklung virusresistenter Roggensorten (Kastirr et al., 2011).

In den bisher untersuchten europäischen Triticalesorten konnten keine Resistenzen gegen Furoviren gefunden werden.

Aus der Anfälligkeit einiger Gerstenformen für SBWMV-N/-NY leitet sich eine mögliche Beeinträchtigung des Gerstenanbaus durch das SBWMV ab.

Aus dem Auftreten des SBWMV-NY in Schleswig-Holstein und des SBWMV-N in Südpolen ergibt sich die Notwendigkeit des Monitorings bodenbürtiger Viren in Europa zur Identifizierung neuauftretender Virusstämme und zur Aufklärung ihrer Bedeutung für den Getreideanbau. Vor der Züchtungsforschung steht die Aufgabe, Resistenz­quellen in Roggen und Triticale zu evaluieren und in die Sortenentwicklung zu integrieren, das Spektrum resistenter Weizensorten zu erweitern und die Bedeutung des SBWMV für die Kulturgerste zu untersuchen.