Unterscheidet sich das Inokulationsergebnis verschiedener Impfmittel bei Soja?

Do soybean inoculants differ in their inoculation efficacy?

Material und Methoden

Bei den Sojasorten handelt es sich um die in Deutschland anbaurelevante, frühreife Sorte Merlin (000, Züchter Prograin Eurasia B.V.) zur Futterproduktion sowie um die Sorte Primus (00; Züchter Saatbau Linz), die unter anderem in Deutschland zur Herstellung von Tofu und Sojamilch verwendet wird. Da Fix Fertig-Saatgut der Sorte Primus vom Hersteller nicht angeboten wird, diente die Sorte Cordoba (000/00, Züchter Saatbau Linz) als Ersatz. Zur Vorbereitung der Aussaat wurden sowohl die Tische im Gewächshaus als auch alle Pflanzgefäße (Länge × Breite × Tiefe: 15 × 15 × 18 cm; nach Versuchen von Schill et al., 2010) zwei Tage vor Anlage des Versuches mit 70%igem Äthanol gereinigt, um eine etwaige Kontamination mit noch aktiven Rhizobien aus früheren Versuchen auszuschließen. Anschließend wurden die Gefäße mit einem Substrat aus gedämpftem Lösslehm und Sand im Verhältnis 3:2 befüllt. Diese Mischung erlaubt später ein einfaches Auswaschen der Wurzeln und Knöllchen. Um eine Vermischung der Rhizobien von verschiedenen Versuchsvarianten durch Gießwasser zu vermeiden, wurde jedes Gefäß auf einen separaten Untersetzer gestellt.

Im nächsten Schritt wurde das Sojasaatgut (Z-Saatgut) mit den verschiedenen Produkten entsprechend der Anleitung beimpft. Hierfür wurde von einer fiktiven Aussaatmenge von 100 kg ha^–1 ausgegangen und die erforderliche Menge Impfmittel für Saatgutportionen von jeweils 100 g berechnet (Tab. 1). Die Inokulation mit dem Produkt NPPL HiStick (IM4) ist laut Hersteller sowohl trocken als auch mit Wasser vermengt möglich; in diesem Versuch wurde eine Trockeninokulation gewählt.

Anschließend wurden im Gewächshaus zunächst sieben Samen in vorgeformte, 4 cm tiefe Löcher in den Pflanzgefäßen ausgesät und mit Erde bedeckt, um sicher zu stellen, dass eine Pflanze pro Gefäß aufläuft. Um Kontaminationen der unbehandelten Kontrolle mit Rhizo­bien der anderen Varianten zu vermeiden, wurde zuerst die unbeimpfte Kontrolle ausgesät und anschließend schrittweise jede inokulierte Variante. Nach Beendigung der Aussaat einer Variante wurden die Arbeitshandschuhe gewechselt und alle Arbeitsgeräte mit 70%igem Äthanol gründlich gereinigt. Nachdem das zweite Laubblatt am zweiten Nodium entfaltet war (BBCH 12), wurden die Pflanzen pro Gefäß auf eine kräftig entwickelte Pflanze vereinzelt. Dieses Vorgehen diente dazu, genau eine normal entwickelte Pflanze pro Gefäß für den eigentlichen Versuch zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt waren noch keine Knöllchen sichtbar, sodass ein Effekt der unterschiedlichen Präparate auf die Pflanzenentwicklung in diesem Stadium ausgeschlossen sein sollte.

Die Beleuchtung über Gewächshauslampen (Philips MASTER SON-T PIA Agro 400 W E E40 SLV; Abstand Lampe zu Pflanze der Pflanzenentwicklung angepasst) sollte die Auflauf- und Entwicklungsbedingungen der Sojapflanzen optimieren. Sie wurden zunächst auf 12 Stunden Leuchtdauer eingestellt, und nachdem das erste Laubblattpaar entfaltet war (BBCH 11) auf 14 Stunden. Aufgrund sehr hoher Außentemperaturen wurden die Lampen ab dem 25. Mai 2012 ausgeschaltet.

Am 7. Mai 2012 wurden die Pflanzen wegen des Befalls mit Weißer Fliege (Trialeurodes vaporariorum) mit einer 4%igen Lösung Neem TS behandelt, ansonsten erfolgten keine weiteren Pflanzenschutz- oder Düngungsmaßnahmen.

Auch Unterschiede in der Intensität der Grünfärbung der oberirdischen Biomasse wurden mit Hilfe einer Boniturskala bestimmt, nachdem die ersten Hülsen an den Pflanzen sichtbar wurden (BBCH 69). Hierzu wurde die Grünfärbung des Sprosses in die Klassen 1 (schwache/helle Grünfärbung), 3 (mittlere Grünfärbung), 5 (starke/dunkle Grünfärbung) eingeteilt, um den Zustand der Pflanze zu beurteilen.

Zur Bestimmung der unterirdischen Biomasse wurde der Wurzelballen auf einem Wurzelwaschtisch vorsichtig ausgewaschen. Um die Funktionsfähigkeit der Knöllchen zu beurteilen, wurden von verschiedenen Stellen jeder Wurzel zufällig fünf Knöllchen entnommen und mit einem Skalpell in zwei Hälften zerteilt. Mit Hilfe des Boniturschemas der BioAustria (BioAustria, 2012) wurde anschließend die N-Fixierungs-Aktivität der Knöllchen bestimmt. War das Innere rosa bis rot gefärbt, so galten alle Knöllchen dieser Wurzel als aktiv. Bei abweichender Färbung einer oder mehrerer Knöllchen wären die betref­fenden Pflanzen gesondert auszuwerten gewesen; dieser Fall trat jedoch nicht ein.

Die Bestimmung der Trockenmasse von Hülsen, Spross und Wurzeln mit Knöllchen erfolgte nach der Trocknung für vier Tage bei 80°C.

Größenklassifizierung der Knöllchen im Labor. Eine Einteilung der Knöllchen in Größenklassen sollte Aufschluss über eventuelle Unterschiede des Einflusses der Impfmittel auf die Knöllchenausbildung geben. Dazu wurde eine Schablone angefertigt, die aus 14 verschiedenen Größenklassen von ≤ 1,0 mm bis ≥ 7,1 mm Durchmesser bestand. Nach dem Separieren von Wurzel und Knöllchen jeder Pflanze wurde mit Hilfe dieser Schablone die Größenklasse jedes einzelnen Knöllchens bestimmt. Anschließend wurden für jede Pflanze die Knöllchenanzahl je Größenklasse sowie die Gesamtanzahl erfasst und die Trockenmasse von Knöllchen je Klasse und Pflanze und der verbliebenen Wurzel ermittelt.

Die Daten zur Aufteilung der Knöllchen in Größenklassen und zur Bestimmung der Farbintensität des Sprosses wurden deskriptiv ausgewertet, indem die Mittelwerte der vier Wiederholungen jeder Variante berechnet wurden.

Ergebnisse

Die Behandlung mit IM2 resultierte bei der Sorte Merlin im signifikant geringsten Knöllchenansatz (fünf Knöllchen pro Pflanze; Abb. 1). Mit IM5 behandeltes Saatgut der Sorte Merlin führte zum höchsten gemessenen Knöllchenansatz (im Schnitt 143 Knöllchen/Pflanze). Bei der Sorte Primus bildete sich ebenfalls nach der Behandlung mit IM2 der geringste Knöllchenansatz mit im Mittel 28 Knöllchen pro Pflanze, ohne signifikante Unterschiede zu den Varianten IM1 und IM6. Die Inokulation mit IM3, IM4, IM5 und IM7 ergab 74 bis 99 Knöllchen pro Pflanze.

Abb. 1. Anzahl von Knöllchen pro Pflanze bei zwei So­jasorten in einem Ge­fäßversuch in Abhängigkeit vom Impfmittel. A: Sorte Merlin, Standardfehler des Mittelwerts = 9,67. B: Sorte Primus bzw. Cordoba, Standardfeh­ler des Mittelwerts = 6,59. Mittelwerte mit demselben Buchstaben sind nicht signifikant verschieden; p ≤ 0,05.

Nodule number per plant of two soybean va­rieties in a pot experi­ment dependent on the rhizobial inoculant. A: Variety Merlin, stan­dard error of mean = 9.67. B: Variety Primus or Cordoba, respecti­vely; standard error of mean = 6.59. Means followed by different letters are statistically different; p ≤ 0.05.

Beim Sortenvergleich innerhalb der Behandlungen bildete Primus in den Varianten IM2 (signifikant) und IM4 mehr Knöllchen als Merlin (nicht dargestellt), Merlin bildete entsprechend mit IM3, IM5, IM6 und IM7 tendenziell mehr Knöllchen.

Abb. 2. Knöllchentrockenmas­se pro Pflanze zweier Sojasorten in einem Ge­fäßversuch in Abhän­gigkeit vom Impfmittel. A: Sorte Merlin, Stan­dardfehler des Mittel­werts = 0,02. B: Sorte Primus bzw. Cordoba, Standardfehler des Mit­telwerts = 0,02. Mit­­telwerte mit demselben Buchstaben sind nicht signifikant verschie­den; p ≤ 0,05.

Nodule dry matter per plant of two soybean va­rieties in a pot experi­ment dependent on the rhizobial inoculant. A: Variety Merlin, stan­dard error of mean = 0.02. B Variety Primus or Cordoba respecti­vely; standard error of mean = 0.02. Means followed by different letters are statistically different; p ≤ 0.05.

Merlin bildete mit IM2 die geringste oberirdische Biomasse (7,4 g TM pro Pflanze; Abb. 3). Maximal betrug die oberirdische Biomasse von Merlin 18,9 g TM pro Pflanze (mit IM3), jedoch ohne signifikante Unterschiede zu IM4, 5, 6 und 7. Bei den Sorten Primus (IM2 bis 6) bzw. Cordoba (IM1 und IM7) zeigten sich keine signifikanten Effekte in der oberirdischen Biomasse durch die unterschiedlichen Impfmittel. Merlin und Primus unterschieden sich in den Varianten IM3, IM4, IM5 und IM6 signifikant in der Biomasseproduktion (Merlin > Primus; nicht dargestellt).

Abb. 3. Oberirdische Biomasse pro Pflanze zweier Sojasorten in einem Gefäßversuch in Abhängigkeit vom Impf­mittel. Die gestrichelte Linie zeigt die Trockenmasse der jeweiligen Kontrollpflanzen an. A: Sorte Mer­lin, Standardfehler des Mittelwerts = 1,07. B: Sorte Primus bzw. Cordoba, Standardfehler des Mittelwerts = 0,88. Mittelwerte mit demselben Buchstaben sind nicht signifikant verschieden. p ≤ 0,05.

Aboveground biomass per plant of two soybean varieties in a pot experiment dependent on the rhizobial inoculant. Broken line shows respective dry matter of control plants without inoculant. A: Variety Merlin, standard error of mean = 1.07. B Variety Primus or Cordoba, respectively; standard error of mean = 0.88. Means followed by different letters are statistically different; p ≤ 0.05.

Die Wurzeltrockenmasse der Sorte Merlin schwankte zwischen 1,2 (IM2) und 1,8 g TM pro Pflanze (IM3; Abb. 4), die der Sorte Primus war in IM4 (2,5 g TM pro Pflanze) am signifikant höchsten. Primus bildete tendenziell in allen Behandlungen mehr Wurzelmasse als Merlin, und dabei signifikant mehr mit den Behandlungen IM2, IM4 und IM5 (nicht dargestellt).

Abb. 4. Wurzeltrockenmasse pro Pflanze zweier Sojasorten in einem Gefäßversuch in Abhängigkeit vom Impf­mittel. Die gestrichelte Linie zeigt die Trockenmasse der jeweiligen Kontrollpflanzen an. A: Sorte Mer­lin, Standardfehler des Mittelwerts = 1,07. B: Sorte Primus bzw. Cordoba, Standardfehler des Mittelwerts = 0,88. Mittelwerte mit demselben Buchstaben sind nicht signifikant verschieden. p ≤ 0,05.

Root dry matter per plant of two soybean varieties in a pot experiment dependent on the rhizobial inocu­lant. Broken line shows respective dry matter of control plants without inoculant. A: Variety Merlin, stan­dard error of mean = 0.02. B Variety Primus or Cordoba, respectively; standard error of mean = 0.02. Means followed by different letters are statistically different; p ≤ 0.05.

Die gesamte Knöllchenmasse pro Pflanze korrelierte bei der sehr frühreifen (000) Sorte Merlin eng positiv und signifikant mit dem oberirdischen Aufwuchs sowie der zu diesem Zeitpunkt gebildeten Anzahl Hülsen (Tab. 4). Die Anzahl der Knöllchen war dabei unter­geordnet. Bei der 00-Sorte Primus konnten diese Korrelationen nicht festgestellt werden; möglicherweise wäre bei der später reifenden Sorte Primus eine ähnliche Korrelation wie bei Merlin zu messen gewesen, jedoch zu einem späteren Zeitpunkt.

Abb. 5. Anzahl von Knöllchen pro Pflanze zweier Sojasor­ten in einem Gefäßversuch in Abhängigkeit von der Größenklasse der Knöllchen. A: Sorte Merlin. B: Sorte Primus bzw. Cordoba. Daten wurden de­skriptiv ausgewertet.

Number of nodules per plant of two soybean varie­ties in a pot experiment dependent on the size clas­sification of nodules. A Variety Merlin. B: Variety Primus or Cordoba, respectively. Data were analyzed descriptively.

Diskussion

Die hohe Anzahl an Knöllchen bei den Pflanzen in der Variante IM7, die aus der Kombination des vorinokulierten Saatgutes und IM6 bestand, kann durch die Addition der Rhizobienzellen beider Impfmittel entstanden sein. Dadurch hätte sich die Rhizobienanzahl pro Samen erhöht, mit einem potenziell höheren Infektionserfolg. Speziell auf Flächen mit erstmaligem Anbau von Soja könnte in Deutschland eine doppelte Inokulation über­legenswert sein, zumal unter den im Vergleich zu den Versuchsbedingungen deutlich kühleren Temperaturen im Freiland grundsätzlich ein tendenziell geringerer Knöllchenansatz zu erwarten ist.

Mit IM4 beimpfte Pflanzen zeigten trotz der laut Herstellerangaben höchsten Menge an Rhizobienzellen (4 × 10⁹ KbE g^–1) in diesem Versuch einen vergleichs­weise mäßigen Knöllchenansatz. Möglicherweise waren Angaben zur Rhizobiendichte in den Impfmitteln nicht sehr exakt, oder auch die Formulierung des Impfmittels beeinflusste die Nodulation. Die Behandlung des Saatguts mit auf Torf basierenden Impfmitteln ohne zusätz­liche Befeuchtung (wie es in diesem Versuch bei IM4 gehandhabt wurde) könnte zu dem geringeren Knöllchenansatz geführt haben. Nach der trockenen Inokulation besteht die Möglichkeit, dass nicht das komplette Impfmittel am Saatgut haftet, sondern ein Teil schon während der Inokulation verloren geht oder bei der Aussaat in der Sämaschine verbleibt. Auch bei einer zusätzlichen Befeuchtung sollte das Saatgut zügig nach der Beimpfung ausgesät werden, da sich sonst das angetrocknete Inokulum wieder vom Saatgut lösen kann (Gault, 1978 zitiert nach Deaker et al., 2004). Zusätze wie Haftmittel können die Nodulation beeinflussen, indem sie zum besseren Anhaften der Rhizobienzellen an das Saatgut beitragen (Brockwell, 1977). Dadurch ließe sich der hohe Knöllchenansatz in der Variante IM3 erklären.

Nicht sterilisierte Trägermedien können die Nodulation grundsätzlich begrenzen, da Kontaminationen durch andere Mikroorganismen die Lebensdauer der Rhizobienzellen herabsetzen (Roughley, 1970). Eine solche Kontamination ist als Ursache für die geringe Nodulation bei einigen im Versuch verwendeten Präparaten nicht auszuschließen.

Oftmals wird in der Praxis vom Hersteller vorinoku­liertes Saatgut bevorzugt, da das beimpfte Saatgut lediglich ausgesät werden muss. Eine gewisse Unsicherheit bei diesem Verfahren stellt die Lagerungsumgebung, z.B. beim Händler oder Landwirt, in Verbindung mit dem Zeitraum zwischen Inokulation und Aussaat dar.

Gemell et al. (2005) zeigten für verschiedene Leguminosen, dass vorinokuliertes Saatgut im Alter zwischen durchschnittlich 70–96 Tagen, aufgrund einer deutlich geringeren Anzahl lebender Rhizobienzellen, einen signifikant geringeren Knöllchenansatz als frisch inokuliertes Saatgut zur Folge hatte. Daher sollte eine genügend hohe Anzahl an Rhizobienzellen im Impfmittel sowie die Verwendung von Rhizobienstämmen, die gegen ein Austrocknen der Saatgutbeschichtung tolerant sind, Voraussetzung bei der Produktion von vorinokuliertem Saatgut sein (Deaker et al., 2004). Unpassende Lagerbedingungen, wie z.B. hohe Lagertemperaturen oder direkte Sonneneinstrahlung, lassen die Anzahl an lebenden Rhizo­bien schneller sinken. Die Gewähr einer entsprechenden Lagerung beim Zwischenhändler und eine Etikettierung der Verpackung mit Details wie Zeitpunkt der Inokula­tion, Verfallsdatum und Anzahl an Rhizobienzellen könnte die Qualität des vorinokulierten Saatgutes sicherstellen (Lupwayi et al., 2000; Gemell et al., 2005). Im aktuellen Versuch könnte somit einer der Gründe für den geringen Knöllchenansatz bei der Variante IM1 das Alter der Rhizobien auf dem Saatgut gewesen sein. Die Zeitspanne zwischen Inokulation beim Hersteller und Aussaat betrug hier ca. 4–5 Wochen, sodass sich trotz optimaler Lager­bedingungen die Anzahl lebender Rhizobien stark ver­ringert haben könnte.

Die einfache Bonitur der Grünfärbung des Blattes im vorgestellten Versuch zeigte einen deutlichen Zusammenhang mit dem Inokulationserfolg; eine noch exaktere und weiterführende Methode, um eine erfolgreiche Inokulation zerstörungsfrei und schnell zu überprüfen, wäre die Messung des relativen Chlorophyllgehalts mit dem SPAD Chlorophyll Meter. Hierbei misst das Gerät die Absorption von rotem und infrarotem Licht (bei 650 bzw. 940 nm Wellenlänge) im Blatt und bestimmt daraus den Chlorophyllgehalt (Thompson et al., 1996). Die Messung sollte zwischen Beginn der Blüte (BBCH 61) und Beginn der Hülsenfüllung (BBCH 72) stattfinden, da zuvor der Photosyntheseapparat noch nicht komplett entwickelt ist und anschließend Stickstoff für die Kornfüllungsphase wieder aus den Blättern umverlagert wird (Thompson et al., 1996). Weiterhin muss beachtet werden, dass sich Sojasorten in der Höhe des Chlorophyllgehaltes generell unterscheiden können und somit die SPAD Werte von Sorte zu Sorte variieren (Fritschi und Ray, 2007).

Deutlich wird der Zusammenhang zwischen Knöllchenmasse und ober- bzw. unterirdischer Biomasse besonders bei der Sorte Merlin (beimpft mit IM4) unter zusätzlicher Berücksichtigung der Größenklassifizierung: Hier bildeten sich zwar verglichen mit anderen Varianten weniger Knöllchen, jedoch hatten diese ein hohes Trockengewicht, sodass sich die ober- und unterirdische Biomasse auf dem gleichen Niveau wie bei Pflanzen in Varianten mit einem hohen Knöllchenansatz befand.

Auf der anderen Seite bieten größere Knöllchen Vor­teile für die Stickstofffixierung in Stresssituationen wie z.B. unter Wassermangel. Wasser und Glukose aus der Photosynthese werden ausschließlich über das Phloem zu den Knöllchen transportiert (Walsh et al., 1989). In einer Studie von King und Purcell (2001) war der relative Wassergehalt in großen Knöllchen höher als in kleinen Knöllchen. Der Grund hierfür ist vermutlich die größere Nachlieferung aus dem Phloem, da große Knöllchen relativ gesehen mehr Stickstoff fixierendes Gewebe besitzen. Der daraus folgende höhere Energiebedarf resultiert also in einer größeren Sink-Kapazität, was wiederum zu einer größeren Nachlieferung an Wasser und Glukose führt.