Einfluss von Kupfer auf die Aktivität von Bodenmikroorganismen in ausgewählten Böden deutscher Weinanbaugebiete

Influence of copper on the activity of soil microorganisms in selected German vineyards

Die OECD fordert in der Richtlinie für die Prüfung von Chemikalien, Abschnitt 2: Auswirkungen auf die biotischen Systeme Labor-Untersuchungen aus dem Bereich der Kohlenstoff-Mineralisation (Test Guideline Nr. 217: Bodenmikroorganismen: Kohlenstoff-Transformations-Test) und Stickstoff-Transformation (Test Guideline Nr. 216: Bodenmikroorganismen: Stickstoff-Transformations-Test). Nationale und internationale Organisationen wie IOBC, EPPO, VDLUFA und die Normungsinstitutionen wie DIN, CEN und ISO haben dazu eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung von Böden und Bodensubstraten beschrieben und validiert. Nach diesen Methoden erfolgte eine Bestimmung und Berechnung der Aktivitäts- und Summenparameter der Bodenmikroorganismen.

Um die Effekte einer langjährigen Anwendung von Kupfer in Weinbergsböden zu untersuchen, wurden 8 Betriebe, die über die Qualitätsweinbaugebiete Deutschlands repräsentativ verteilt sind, beprobt. Je Betrieb wurden im Regelfall 3 Versuchsglieder, eine in Bewirtschaftung befindliche Fläche (Prüffläche), eine möglichst niemals genutzte Fläche (Kontrolle) und eine ehemals genutzte Fläche (Referenz nur für Regenwurm-Tests) in die Untersuchungen einbezogen. Von jeder Fläche wurden Teile des Bodens der 4 Versuchsglieder (je 0,25 m²) im Bodenhorizont 0–20 cm entnommen, zu einer Mischprobe vereint, auf 5 mm gesiebt, in verschließbaren 15 l Polyethylen-Eimern abtransportiert und bis 1 Woche vor Versuchsbeginn im Labor bei 4°C im Dunkeln gelagert.

Diese Böden decken geringe bis mittelhohe Kupferbelastungssituationen in einem Bereich zwischen 20 mg und 350 mg Cu/kg Boden TM ab. Zwischen 2,3 und 12,5% variiert bei diesen Böden der Anteil der organischen Substanz.

Die Auswahl der Kontrollböden erfolgte auf Flächen (vergleichbare physiko-chemische Bodeneigenschaften) in geographischer Nähe, die nach Aussage der Winzer nicht in landwirtschaftlicher Nutzung waren und demzufolge eine ortstypische geogene Belastungssituation mit Kupfer widerspiegeln.

Die Lagerung der Proben im Labor erfolgte nach Bestimmung der Restfeuchte (DIN ISO 11465), pH-Wert (DIN ISO 10390) und der maximalen Wasserhaltekapazität (E DIN ISO 11274) bei 4°C in einer Kühlzelle in Dunkelheit für maximal 2 Monate.

Die Analyse der Kupfer-Gehalte erfolgte nach VDLUFA (1991). Die Bestimmung der bodenkundlichen Basis­parameter wurde in Strumpf et al. (2011) beschrieben.

Die beiden Böden LAGD und K_73 (Tab. 1) sind unterschiedlich gelagerte Kontrollböden mit bekannter biologischer Charakterisierung und Verhalten im Labor.

Dehydrogenase-Aktivität ist ein sensitiver Indikator für eine Schwermetalltoxizität (Dick et al., 1996; Rossel et al., 1997). Die zur Bestimmung der Aktivität gemessene Formazan-Bildung kann durch das Kupfer in den Böden beeinflusst werden (Chandler und Brookes, 1991; Brookes, 1995). Deshalb wurde zur Überprüfung der Beeinflussung der Dehydrogenase-Aktivität Iodotrazoliumchlorid (INT) eingesetzt (Obbard, 2001). Eine Beeinflussung der Prüf- und Kontrollböden konnte nicht festgestellt werden.

Jeweils 5 g TS Boden werden mit 6 ml Triphenyltetrazoliumchlorid-Pufferlösung (bzw. INT-Pufferlösung) überschichtet und 16 h bzw. 18 h bei 30°C im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wird mit 25 ml Aceton abgestoppt. Nach weiteren 2 h wird die Lösung filtriert und spektralphotometrisch die Extinktion des gebildeten Formazans bei einer Wellenlänge von λ = 485 nm mit einem UV VIS Spektralphotometer Specord^® 205 der Firma Analytik Jena AG gemessen.

Die Aktivität der Dehydrogenasen wird in μg TPF/g TM * 16 h^–1 (DIN ISO 23753-1) bzw. in μg INTF/g TM * 18 h^–1 (DIN ISO 23753-2) angegeben.

Die Bodenproben (Wk_max ca. 50%) werden in einem geschlossenen Gefäß bei 20°C für 24 Stunden im Dunkel inkubiert und das gebildete CO₂ in Natronlauge absorbiert. Der daraus resultierende Unterdruck wird manometrisch gemessen (OxiTop^®-Verfahren). Die Druckänderung ist proportional zur Masse an verbrauchtem Sauerstoff. Die LZA und SIR werden in mg O₂/kg Boden TM * h^–1 angegeben. Mit dem Faktor 1,375 kann der Sauerstoff-Verbrauch in Kohlenstoffdioxid-Bildung umgerechnet werden [mg CO₂/kg TM * h^–1] (DIN EN ISO 16072).

Nach Bestimmung der optimalen Konzentration (maximale Atmungsrate bei Substratzusatz) für die jeweiligen Böden werden für die SIR-Bestimmung die Proben mit Glukose als schnell zu metabolisierendes C-Substrat versetzt und über 12 h bei 20°C im Dunkeln die unmittelbar folgende Atmungsreaktion manometrisch (wie oben beschrieben) gemessen (DIN EN ISO 14240-1:2011). Die Druckänderung in den ersten 3 Stunden wird nicht in die Auswertung einbezogen, weil sich hier erst ein ther­misches Gleichgewicht einstellt. Die Bodenatmung läuft dann ca. 6 Stunden linear bis die Vermehrung der Mikro­organismen einsetzt.

Mittels der Daten aus dem Substrat-induziertes Respirationsverfahren wird die mikrobielle Biomasse in den Bodenproben bestimmt. Die Berechnung erfolgt nach der Gleichung X = 40 R + 0,37 (X = Masse des C_mik im Boden [mg CO₂/kg TM]; R = CO₂-Bildung [ml CO₂/kg * h^–1]).

Metabolischer Quotient (qCO₂). Der metabolische Quotient wird aus dem Verhältnis zwischen Basalatmung, genauer gesagt aus dem Kohlenstoffanteil des veratmeten CO₂ und der mikrobiellen Biomasse, errechnet. Er wird angegeben in mg CO₂-C h^–1/g C_mik Der metabolische Quotient stellt einen wichtigen physiologischen Parameter zur Charakterisierung der mikrobiellen Biomasse dar und ist ein indirektes Maß für die energetische Effi­zienz der Substratnutzung einer Mikroorganismengesellschaft. Er erlaubt Aussagen über den Einfluss anthropogener und natürlicher Faktoren auf die Biomasse und mikrobielle Aktivitäten. Je niedriger der metabolische Quotient, umso geringer sind die C-Verluste durch Ver­atmung der organischen Bodensubstanz und desto mehr Substrat wird in die mikrobielle Biomasse inkorporiert (Schinner und Sonnleitner, 1996).

Es zeigte sich, dass die ausgewählten Kontrollen nicht immer optimal zu den untersuchten Prüfflächen passten. Im Falle des Kontrollbodens MO_06 kam es zu einer nicht zu klärenden Störung bei der Bestimmung der potentiellen Nitrifizierung. Auch bei der Wiederholung des gesamten Versuches wurde ein negatives Ergebnis erzeugt. Der bestimmte pH-Wert für den Boden lag bei 5. In der Kontrolle des Betriebes BA_01 war die potentielle Nitrifizierung, gemessen durch das Schnellverfahren mittels Ammoniumoxidation sehr hoch. Die anderen Parameter wie Atmung und Dehydrogenase-Aktivität zeigten aber ein vergleichbares Verhalten zur Prüffläche.

Die berechneten Parameter der mikrobiellen Biomasse, des metabolischen Quotienten und des C_mik/C_org-Verhältnisses zeigen ein uneinheitliches Bild.

Der metabolische Quotient (qCO₂) ist besonders gut geeignet als Indikator bei kurzzeitigen Veränderungen der Umwelt oder Kontaminationen. Da wir aber Böden untersuchten, die z.T. eine 100jährige Bewirtschaftungshistorie (und damit eine langjährige und langsam gestiegene Belastung mit Schwermetallen) aufwiesen, sind bis auf Böden, die einen qCO₂ > 9,0 haben, keine signifikanten Abweichungen (s. Tab. 3) im Vergleich zu den Kon­trollen festzustellen. Bei den Böden aus der Region Mosel trifft das jeweils bei denen zu, die die höchsten Gesamtgehalte an Kupfer (> 200 mg Cu/kg TM) enthielten und den geringsten Anteil an organischer Substanz. Die ansonsten sehr niedrigen Quotienten in den anderen Böden weisen auf keine signifikanten Effekte bei der Veratmung der organischen Bodensubstanz und damit einhergehender C-Verluste hin.

Sehr starke Unterschiede des C_mik/C_org-Verhältnisses im Vergleich Prüffläche und Kontrollfläche würden auf eine nachhaltige Beeinflussung der Kohlenstoff-Dynamik und Schädigung der mikrobiellen Biomasse eines Bodens hinweisen. Wie in Tab. 2 und 3 gezeigt, sind aber gerade die Böden auffällig, die nicht unbedingt einen hohen Gehalt an Gesamtkupfer aufweisen. Diese Auswirkungen sind sehr gut bei den beiden Betrieben BA_01 und MO_03 zu sehen, bei denen es möglich war, zwei in ihrer Boden­charakteristik vergleichbare Prüfflächen mit unterschiedlich hohen Gesamtgehalten an Kupfer zu untersuchen. Obwohl eine Fläche bis zum 8-fachen der Cu-Konzentration der anderen aufwies, waren bei BA_01 die mikro­biellen Parameter vergleichbar, bei den Prüfböden von MO_03 aber deutlich verschieden.

Auch die in den Prüfböden bestimmten mikrobiellen Parameter zeigen deutlich die Heterogenität der untersuchten Böden. Ein Zusammenhang zwischen steigendem Kupfergehalt und nachhaltiger Beeinflussung der Aktivität der Mikroorganismen in den untersuchten Böden konnte nicht gefunden werden.

Auch die Art des applizierten Kupfers (als Salz, als Kompost oder in flüssigen Klärschlemmen) beeinflusst die Bioverfügbarkeit entscheidend (Giller et al., 2009).

Wakelin et al. (2010) untersuchten den Zusammenhang zwischen steigendem Gehalt an Kupfer (als CuSO₄ appliziert), der Zusammensetzung der Mikroorganismengesellschaft und der Aktivität beim Abbau von organischem Material in einem 6-jährigen Freilandversuch. Sie fanden keinen Zusammenhang zwischen Effekten auf die Basalatmung und steigenden Kupfergehalten (von 0 bis 3225 mg Cu/kg Boden TM). Das liegt einerseits daran, dass die Bioverfügbarkeit von Kupfer eine große Rolle spielt. Die Prozesse der sogenannten Alterung verringern eine mögliche Toxizität gegenüber den Mikroorganismen. Die physiko-chemischen Eigenschaften der Böden (z.B. Korngrößenverteilung, organischer Kohlenstoffgehalt, Kationenaustauschkapazität, pH-Wert) bestimmen das Maß der Auswirkungen auf die Aktivitäten und Leistungen der Bodenmikroorganismen.

Andererseits wurden den Böden keine Mikroorganismen zugesetzt. Es wurde nur mit den in den Böden vorhandenen Populationen getestet. Diese Populationen hatten z.T. 50 Jahre und länger Zeit, sich den steigenden Cu-Gehalten anzupassen.

Wang et al. (2007a) beschrieben dagegen eine nega­tive Korrelation zwischen mikrobieller Biomasse und erhöhtem Cu-Gehalt.

Weiter lassen sich die Effekte ohnehin nicht nur mit einer erhöhten Kupferkonzentration beschreiben. Untersuchungen ergaben, dass auch andere Metalle in durchaus hohen Konzentrationen im Boden bestimmt wurden und bioverfügbar waren (Steindl et al., 2011). So wurde zum Beispiel ein erhöhter Gehalt von Zink durch das Nutzen von Zn-Stickeln für die Befestigung der Weinreben erklärt. Weitere bestimmte Elemente wurden wahrscheinlich mit den früher üblicherweise eingesetzten wasserlöslichen Holzschutzmitteln auf Salzbasis (Arsen-, Chromverbindungen) und Pflanzenschutzmitteln (z.B. Schweinfurter Grün) eingebracht. Ob aber eine Einzelwirkung durch Kombinationseffekte mehrerer Elemente übertroffen wird, ist in der Literatur nicht eindeutig belegt (Malkomes, 2010a).

Die Herkunft und Heterogenität der Böden macht es schwierig, nur die Effekte von Kupfer auf die jeweiligen kurz- oder längerfristigen Endpunkte der Prüfverfahren zu bestimmen. Es ist bei der Probenahme in den aus­gewählten Winzerbetrieben nicht immer gelungen, eine geeignete Kontrolle mit vergleichbaren Bodeneigenschaften und Bodenleben zu finden. Das lag daran, dass die Probenahme gezielt für das Regenwurmmonitoring durchgeführt wurde. In den Tests kamen deshalb auch immer sogenannte Kontroll- oder Referenzböden (K_73 und LAGD) aus dem Dahlemer Versuchsfeld mit langjähriger Erfahrung über deren Wirkverhalten zum Einsatz, u.a. um zu überprüfen, wie sich die Testorganismen während der Prüfungen verhalten. Bei Durchführung der Laborversuche zu den unterschiedlichen Zeitpunkten waren die bestimmten Parameter der mikrobiellen Aktivitäten in diesen Böden vergleichbar.

Der Vergleich der Böden von den untersuchten Prüf­flächen und den Kontrollen ist in Tab. 4 dargestellt. Zum besseren Verständnis und Vergleich enthält die Tabelle auch die für den jeweiligen Boden bestimmten Gesamtgehalte an Kupfer und den Gehalt an organischer Sub­stanz.

Die im Vergleich zum Kontrollboden signifikanten Unterschiede (DUNNETTS einseitige t-Test mit p ≤ 0,05) lassen sich keiner erhöhten Konzentration an Gesamt-Cu im Boden zuordnen. Eine gesicherte Korrelation mit anderen (Boden-)Parametern lässt sich z.Zt. auf Grund der bisher geprüften 8 Betriebe noch nicht durchführen. Die Situation kann sich verbessern, wenn – wie geplant – noch weitere Betriebe beprobt werden.

Eine zum Teil über Jahrzehnte adaptierte Mikroflora kann ebenfalls eine allgemeine Aussage erschweren. Das Problem bei der Bestimmung der Metall-Toxizität gegenüber Mikroorganismen im Boden ist, dass nachhaltige Auswirkungen auf Stämme einer bestimmten Art, oder auf andere Arten oder Gattungen von Mikroorganismen, die eine bestimmte Funktion im Habitat ausüben, leicht übersehen werden, wenn eine Spezies ersetzt oder deren Funktion von anderen übernommen wird.

Auch die Qualität des vorhandenen oder zugegebenen Substrates zur C-Mineralisierung ist mitentscheidend für die Sensibilität gegenüber einer Kupferkontamination (Giller et al., 1998).

Ge und Zhang (2011) fanden durch Analyse der mikrobiellen Populationen mittels Profile und Indikatoren der Phospholipidfettsäuren (PLFA) und Multiplex-terminalen Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (M-TRFLP) Fingerprinting-Verfahren bei gleichzeitiger Analyse der Vielfalt und Community-Struktur, dass Pilze eher und deutlicher auf Kupfer reagieren als Bakterien und Archaeen. Dabei sanken die PLFA-Indikatoren für Gram-positive Bakterien (16:0i, 15:0i) und Pilze (18:2w6,9) mit steigender Cu-Konzentration, während die Indikatoren für Gram-negative Bakterien (19:0cy, 16:1w7) anstiegen. Die pilzliche Gemeinschaft war sensibler als Bakterien und Archaeen. Ranjard et al. (2006) fanden, dass eine Cu-Konzentration von weniger als 20–60 μg g^–1 die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft schon verändern kann. Eine höhere Cu-Konzentration (1000 μg g^–1) wurde als ein Schwellenwert für toxische Wirkungen auf der Grundlage von PLFA Profile (Bååth et al., 1998) beschrieben. Aufgrund der PLFA und bakterielle TRFLP Ergebnisse wurden Grenzwerte für die Toxizität im Boden vorgeschlagen, die zwischen 351–708 μg g^–1 total Cu oder 126–184 μg war g^–1 verfügbares Cu lagen. Setzte man die pilzlichen TRFLP Profile als Maßstab, wurden niedrigere Schwellenwerte gefunden (170–351 μg g^–1 total Cu oder 50–126 μg g^–1 verfügbares Cu).

In dieser Arbeit wurde bisher auf die im Zulassungsverfahren geforderten Parameter eingegangen. Für eine bessere Erklärung der Phänome müssen aber auch Methoden gewählt werden, die z.B. eine Verschiebung der Biodiversität der Populationen von Mikroorganismen erfassen können.

Dell´Amico et al. (2008) bestätigten diesen Effekt in ihren Untersuchungen von zwei Weingärten im Piemont, Nord-Italien. Zwar war an beiden Standorten der Anteil Cu-toleranter Bakterien hoch, doch herrschten im geringer mit Cu belasteten Boden gram-positive Bakterien vor, im höher belasteten dagegen gram-negative.

Ein Problem vieler Untersuchungen über den Einfluss von Kupfer ist, das der Boden vor Beginn der Unter­suchungen erst mit Kupfer oder Gemischen von Schwermetallen versetzt wurde. (Chandler et al., 1995; Wilke et al., 2005). Zu dieser Zeit ist die Bioverfügbarkeit relativ hoch und damit verbunden die toxische Wirkung. Für die Zulassung von Pflanzenschutzmitteln ist dieser „worst case“ gut geeignet, mit dem Wissen, dass es im Freiland solche Bedingungen nicht gibt und hier eine Art Sicherheitsfaktor eingebaut wird. Nach Ausbringen kupferhal­tiger Präparate wird das Schwermetall relativ schnell an Tonminerale oder organische Substanz gebunden und ist nicht mehr im hohen Maße bioverfügbar.

So untersuchten Wightwick et al. (2013) Weinbergs­böden in Mikrokosmosanlagen im Labor. Der Boden stammte aus den oberen 5 cm. Die Kontrollen wurden ganz in der Nähe genommen mit geringem oder keinem zusätzlichen Kupfer. Die untersuchten Parameter waren Phosphomonoesterase-, Arylsulfatase-, Urease- und Phenoloxidase-Aktivität. Nur bei der Phosphomonoesterase-Aktivität fanden sie eine geringe Abhängigkeit zum Cu-Gehalt.

Aus den gemessenen Werten, z.B. der Bodenatmung (LZA und SIR), lassen sich weitere ökophysiologische Parameter zur Beurteilung der Effekte auf die Bodenmikroorganismen ableiten. Diese sind zum Teil weniger durch Einflüsse der Bodenbewirtschaftung oder Zusatzbepflanzung beeinflusst als die ihnen zugrunde liegenden Einzelparameter. Trotzdem kann man mit ihnen die Qualität und Quantität von Umsetzungsprozessen beschreiben.

In der Abb. 1 sind die Verhältnisse bei den untersuchten Prüf- und Kontrollflächen grafisch dargestellt. Ein höheres C_mik/C_org-Verhältnis verdeutlicht eine effektivere Ausnutzung der organischen Substanz zum Aufbau mikrobieller Biomasse. Neben verschiedenen Eigenschaften der Mikroorganismen und den sie beeinflussenden Umweltbedingungen ist hierfür die Qualität der organischen Substanz wichtig (z.B. leicht oder schwer abbaubar, N-Gehalt). Die organische Substanz der Prüfflächen wurde aber nicht in ihrer speziellen Zusammensetzung untersucht.

Abb. 1. C_mik/C_org-Verhältnis in den Prüfböden im Vergleich zur Kontrolle.

C_mic/C_org-ratio in the test soils compared to controls.

Eine leicht verfügbare Nahrungsquelle kann die Entwicklung der mikrobiellen Biomasse steigern, wohingegen die Zufuhr bereits humifizierten organischen Materials (z.B. gealterter Kompost oder Stallmist) eher den Humusgehalt des Bodens fördert und somit das C_mik/C_org-Verhältnis tendenziell erniedrigt (Reuter, 1999; Reuter und Kubiak, 2001). Laut Aussage der Winzer wurden kurz vor dem Zeitpunkt der Probenahme keine dieser Maßnahmen in den Weinbergen durchgeführt. Eine deutliche Störung der mikrobiellen Umsetzungsprozesse konnte nicht beo­bachtet werden. Bei den Prüfböden BA_01 und MO_03 mit den jeweils unterschiedlich hohen Kupfer-Gesamt­gehalten wurden keine Unterschiede des C_mik/C_org-Verhältnisses festgestellt.

Im Gegensatz dazu beschrieben Bååth et al. (1991) und Fliessbach et al. (1994), dass Metallkontaminationen die Ratio senken. Bei anderen Untersuchungen (Insam et al., 1996) konnten keine Unterschiede zwischen kontaminierten und unkontaminierten Böden festgestellt werden. Ihrer Meinung nach überdeckten andere Parameter wie unterschiedliche Bodeneigenschaften, Textur, pH-Wert und C_org-Gehalt die Ausprägung. Wie schon bei den Modellböden gezeigt, ist auch bei den Prüfböden der Cu-Gehalt nicht entscheidend.

Auch der metabolische Quotient (qCO₂) als indirektes Maß für die energetische Effizienz einer Mikroorganismengesellschaft kann bei einer Erhöhung als Hinweis z.B. auf Stresswirkungen gesehen werden (Anderson und Domsch, 1986b). Unter Stress wird ein höherer Anteil der umgesetzten Energie für lebenserhaltende Prozesse benötigt, so dass Wachstumsprozesse eine Reduzierung erleiden können. Außer dem – lange Zeit trocken ge­lagerten – Kontroll- und Referenzboden LAGD sind die Kohlenstoff-Verluste der Modellböden durch Veratmung der organischen Bodensubstanz gering. Es ist keine Störung der Substrateinlagerung in die mikrobielle Biomasse zu beobachten.

Die berechneten metabolischen Quotienten der Prüfböden (Tab. 3) zeigen ein indifferentes Bild. Sie geben keine Hinweise auf eine negative Auswirkung bzw. eine Stresswirkung bedingt durch einen erhöhten Gesamtgehalt an Kupfer. Die unterschiedlichen Niveaus der einzelnen Weinbauregionen bringen nur zum Ausdruck, dass die jeweiligen Standorte ganz spezifische Boden­charakteristika, Klima und Habitate aufweisen, die alle auf die Diversität und Abundanz der Populationen von Mikroorganismen einwirken.

Fliessbach et al. (1994) und Moreno et al. (1999) beo­bachteten eine Erhöhung des metabolischen Quotienten in Böden, die mit Schwermetallen kontaminiert wurden. Diese gesteigerten Metabolismusraten erklärten sie mit einer unspezifischen Reaktion auf die veränderten Umweltbedingungen und als Stressantwort (Selye, 1950). Die Situation in den Weinbergsböden ist insofern anders, als hier die sukzessive Belastung mit Kupfer über einen langen Zeitraum erfolgte, das Kupfer zum Teil festgelegt wurde und eine Toleranz bzw. Adaption durch die Mikro­organismen aufgebaut werden konnte. Das zeigt sich darin, dass Bodenenzyme durch eine moderate Anwendung von Kupfer nicht oder kaum beeinträchtigt werden (Macdonald et al., 2007).

Auch die durch Ge und Zhang (2011) gemessene Phos­phatase-Aktivität war nicht signifikant durch Schwermetallkontamination beeinflusst.

Bei einigen mikrobiellen Aktivitäten lagen die EC₅₀-Werte für Cu im Boden meistens deutlich höher als der erlaubte jährliche Cu-Eintrag und betrugen z.B. 259 mg/kg (Basalatmung), von 95 bis 850 mg/kg (SIR), von 95 bis 825 mg/kg (Abbau von Maisrückständen), von 73,4 bis 2060 mg/kg (potenzielle Nitrifikation), 150 mg/kg (De­hydrogenaseaktivität), 285 mg/kg (Abbau organischer Substanz). Doch sollten diese Angaben wegen zahlreicher ebenfalls vorliegender niedrigerer Werte aus anderen Untersuchungen zunächst nicht verallgemeinert werden (Malkomes, 2010b).

Andererseits gibt es auch genügend Beweise, die dokumentieren, dass eine Abnahme der Enzymaktivität im Boden ein Ergebnis der langfristigen Exposition gegenüber Schwermetallbelastung ist (Wang et al., 2007b; Speir et al., 2007). An 99 unterschiedlich stark mit Schwerme­tallen einschließlich Cu (6,4–497 mg/kg TM) belasteten Schweizer Freilandböden, darunter 61 Acker- und 9 Weinbergsböden, ermittelten Celardin und Chatenoux (2003) u.a. die mikrobielle Biomasse (ATP-Gehalt) und die Basal­atmung (CO₂-Bildung über 15 d). Sowohl die Biomasse als auch besonders die Atmung nahmen dosisabhängig mit dem Cu-Gehalt im Boden ab, wobei die EC₅₀-Werte für die Atmung bei etwa 259 mg Cu/kg Boden TM lagen. Ein von Wilke et al. (2005) durchgeführter Vergleich von SIR-Atmungskurven nach Glucosezugabe ergab ab etwa 190 mg Cu/kg Boden TM eine deutlich empfindlichere Reaktionen in den frisch mit CuCl₂ versetzten Böden als in den die entsprechenden Mengen gealterter Cu-Rückstände enthaltenden Böden.

Oorts et al., 2006b verglichen die Wirkung auf die SIR in frisch mit Cu-Salzen (Carbonat, Chlorid, Sulfat) versetzten Böden mit der Aktivität in entlang eines Cu-Konzentrationsgradienten entnommenen „gealterten“ Proben. Es ergaben sich EC₅₀-Werte im Bereich von 95 bis > 850 mg Cu/kg Boden TM. Dabei erwiesen sich je nach Boden teilweise die frisch kontaminierten Proben als empfindlicher, teilweise aber auch die anhand eines Cu-Gradienten im Feld entnommenen gealterten.

In einigen Fällen scheint eine lang anhaltende und langsam in der Konzentration steigende Cu-Belastung in Böden zusätzlich die Entstehung Cu-toleranterer mikrobieller Populationen zu ermöglichen (Kamitani et al., 2006).

Seit längerem ist bekannt (Behlau et al., 2012; Lee et al., 1994; Cooksey und Azad, 1992), dass bei Anwendung von Kupfer-haltigen Bakteriziden sich Cu-resistente Stämme entwickeln können. Dies können Spezies sein von Pseudomonaden (Bender und Cooksey, 1986), Pantoea (Nischwitz et al., 2007), Erwinia (Al-Daoude et al., 2009) und Xanthomonaden (Marco und Stall, 1983). Der Mechanismus der Resistenz wird erklärt durch die Akkumulation und Festlegung von Kupfer in den Bakterienzellen mit Hilfe von Proteinen. Der horizontale Transfer ist hauptsächlich verantwortlich für die Weitergabe dieser Eigenschaft an andere Bakterien. Eine Spontanmutation kann fast ausgeschlossen werden, da die Regulierung der Kupferresistenz über mehrere Gene im Organismus erfolgt (Cooksey, 1990). Auch die Mecha­nismen der Toleranz in Bakterien und Pilzen sind sehr vielfältig. Hierbei wird der Begriff Toleranz nach den Empfehlungen von Gadd (1992) genutzt für Fälle, wo ein Entgiftungsmechanismus die Fähigkeit verleiht, unter Bedingungen des Schwermetall-Stresses zu überleben. Diese Mechanismen können sein: Bindung des Metalls durch Proteine, extrazelluläre Polymere oder die Zellwand, Kompartimentierung innerhalb der Zelle, Bildung unlöslicher Metallsulfide, verminderte Aufnahme, verbesserte Freisetzung aus Zellen und Volatilation (Silver und Misra, 1988; Flemming und Trevors, 1989; Cooksey, 1993; Ross, 1993).

Ein weiteres Problem bei Freilanduntersuchungen ist die Mehrfachbelastung z.B. mit anderen Schwermetallen (Strumpf et al., 2011). Hier war – methodisch – keine saubere Trennung der Effekte möglich. Vereinzelt sind in den Weinbergsböden Gesamt-Konzentrationen anderer Metalle gemessen worden, die ebenfalls toxische Effekte bei den Mikroorganismen hervorrufen können. Auch aus der Literatur ist diese Schwierigkeit bekannt. Freiland­untersuchungen nur mit einzelnen Schwermetallbelastungen gibt es kaum.

In dieser Arbeit nicht näher untersucht wurden Einflüsse auf die Diversität der Bodenmikroorganismen. Funktions- und Summenparameter können nicht immer eindeutig zeigen, ob es zu nachhaltigen Auswirkungen gekommen ist. Zum Teil überlagern sich positive und negative Effekte.

Bei einem langfristigen und langsamen Anstieg der Gesamtkonzentration nach Anwendung kupferhaltiger PSM muss damit gerechnet werden, dass sich Cu-resistente Populationen von Mikroorganismen entwickeln und aufbauen können (Brandt et al., 2010). Dieses würde auch die große Differenz bei den Angaben über schädigende Cu-Konzentrationen erklären.

Bei der Prüfung der Böden wurde von den gesetzlich geforderten Untersuchungen bei der Bewertung im Rahmen der Zulassung von PSM ausgegangen und die geforderten Prüfungen zur Beeinflussung der Mikroorganismen im Boden durchgeführt. Nachhaltige Effekte durch hohe Kupferkonzentration auf die bestimmten mikrobiellen Aktivitätsparameter konnten hierbei nicht festgestellt werden. Dies bedeutet aber nicht, dass die Mikro­organismengesellschaften im Boden nicht auf die erhöhten Schwermetallgehalte reagieren. Hierzu sind weitere Untersuchungen notwendig.