Erstnachweis von Diplodia mutila an Ligustrum vulgare – Beiträge zur Taxonomie von Botryosphaeria stevensii Shoemaker

First report of Diplodia mutila on Ligustrum vulgare, taxonomy of Botryosphaeria stevensii Shoemaker

Einleitung

Im Jahr 2011 wurde in einem Privatgarten in Niederösterreich Absterben einer Hecke von Liguster (Ligustrum vulgare L.) beobachtet (Abb. 1).

Abb. 1. Durch Diplodia mutila geschädigte Ligusterhecke.

Auf zurücksterbenden Zweigen waren Pilzfruchtkörper erkennbar, die aufgrund der Morphologie der Koni­dien zur Anamorphe von Botryosphaeria stevensii Shoemaker, Diplodia mutila (Fr.) Mont., gehörten.

B. stevensii ist eine in Früchten, Samen, Zweigen und Blättern endophytische Art (Álvarez-Loayza et al., 2008, 2011). Sie ist weit verbreitet und tritt auf zahlreichen Wirtspflanzen (meist Gehölzen) als Saprophyt und fakultativer Parasit, z.B. Wundparasit auf, was für viele Arten der Botryosphaeriaceae charakteristisch ist (Slippers und Wingfield, 2007). In den vergangenen Jahren wurde B. stevensii als Erreger von Krebswucherungen und Triebsterben an Gehölzen identifiziert. Vor allem im mediterranen Bereich ist der Erreger ein ernstes Problem an Eichen (Ragazzi et al., 2000). Auch im Obstbau nehmen wirtschaftlich bedeutende Schäden durch B. stevensii zu (Martinez, 2010). Liguster war bisher nicht als Wirtspflanze von B. stevensii bekannt.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher zuerst die Identität des Pilzes mittels morphologischer und molekularer Methoden festgestellt, wobei auch auf die Verwandtschaft von Botryosphaeria stevensii/Diplodia mutila und anderen Botryosphaeria- bzw. Diplodia-Arten näher eingegangen wird. Danach wurden biologische Parameter (Temperaturabhängigkeit der Konidienkeimung sowie des Myzelwachstums) und die Pathogenität der Pilzart an Liguster und einigen anderen Gehölzen untersucht.

Material und Methoden

Zusätzlich wurden Herbarbelege von Diplodia mutila (inkl. Synonyme wie Sphaeropsis malorum (Berk.) Berk., D. quercina Westend., D. quercus Fuckel) sowie Belege ähnlicher Arten aus dem Naturhistorischen Museum Wien in die Untersuchungen einbezogen und die Größen der Koni­dien verglichen.

Konidienkeimung. Zur Ermittlung des Beginnes der Konidienkeimung wurden reife Konidien aus Fruchtkörpern vom natürlichen Substrat (Liguster) in Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) – Petrischalen verteilt, die Schalen bei 25°C aufbewahrt und der Zustand der Konidien bis zu deren Keimung stündlich kontrolliert.

Wachstumsversuch. Zur Feststellung der Minimal-, Optimal- und Maximaltemperatur des Myzelwachstums wurden Einzelsporkulturen auf PDA überimpft und die Schalen in Klimaschränken bei 16 h hell/8 h dunkel inkubiert. Das Wachstum wurde bei 5°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, und 35°C untersucht. Der Versuch erfolgte in 20-facher Wiederholung (n = 140).

Nach 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Tagen wurde der Durchmesser des Myzels gemessen. Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Varianzanalyse unter Verwendung von Microsoft Office Excel 2007.

Infektionsversuch. Die Pathogenität des Isolates CJK1 an Liguster und anderen Gehölzarten wurde mittels eines Infektionstests überprüft. Die Auswahl der Arten erfolgte nach ihrer Bedeutung innerhalb der Ziergehölze in Österreich. Im Sommer 2011 wurden jeweils 15 Pflanzen von Ligustrum vulgare ‘Atrovirens‘, Prunus avium, Crataegus monogyna, Thuja occidentalis ‘Smaragd‘ und Forsy­thia × intermedia mit dem Isolat beimpft (Myzel-Inokulation in die Rinde). Weitere 25 Pflanzen wurden als Kontrolle, wie beschrieben, behandelt, aber nicht beimpft. Die inokulierten Pflanzen wurden im Glashaus der Österreichischen Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit (AGES) bei durchschnittlich 27,4°C (Min: 26,5°C, Max: 28,1°C) und durschnittlich 47,1% rF (Min: 35,8% rF, Max: 61,1% rF) exponiert. Die Symptomausprägung an den Versuchspflanzen wurde insgesamt viermal in einmonatigen Abständen erfasst und dokumentiert, die Länge der Nekrosen gemessen und das Auftreten von Fruchtkörpern überprüft. Für die statistischen Berechnungen wurden verschiedene Verfahren unter SPSS 9.0 (SPSS Inc.) verwendet. Zur Erfüllung der Koch‘schen Postulate wurde der Pilz von den infizierten Pflanzen rückisoliert. Die Bestimmung dieser Isolate erfolgte mit molekularen Methoden.

Die DNA wurde mit dem DNeasy^® Plant (Mini) Kit (Qiagen) extrahiert. Die folgenden Genregionen wurden mit den jeweiligen Primern untersucht: 18S, ITS und 28S der ribosomalen DNA (Primer: NS1, NS4; ITS1, ITS4; LR0R, LR5; White et al., 1990), sowie β-Tubulin und Aktin (Bt2a, Bt2b; act-512f, act-783R; Glass und Donaldson, 1995; Carbone und Kohn, 1999). Die PCR wurde nach de Wet et al. (2008) durchgeführt, unter Verwendung von peqGOLD Polymerase (PEQLAB)^*. Die Basenabfolge der so gewonnen Fragmente wurde mittels Sanger-Sequenzierung über einen privaten Anbieter ermittelt (CRC DNA Sequencing Facility, Chicago). Zur Rekonstruktion der Stammbäume wurden Neighbor-joining und Maximum parsimony-Verfahren, die in der Software MEGA Version 5 (Tamura et al., 2011) implementiert sind, verwendet.

In Anlehnung an die Arbeit von de Wet et al. (2008) wurde auch eine gemeinsame Auswertung der ITS, ß-Tubulin und Aktin-Genregionen vorgenommen. Dafür wurden die Alignments dieser drei Genregionen in einer Eingabedatei kombiniert und ähnlich wie die einzelnen Genregio­nen analysiert. Bei dieser Auswertung wurden alle von de Wet et al. (2008) verwendeten Gensequenzen sowie die eigenen Sequenzen von CJK1 (D. mutila) und CJK2 (D. pinea) verwendet. Wie bei de Wet et al. (2008) beschrie­ben, wurde Mycosphaerella konae (Isolat STE-U2125) als Outgroup in dieser Analyse verwendet. Auf die Anwendung eines Partitionshomogenitätstests für diesen kombinierten Datensatz wurde verzichtet, da ein solcher bereits von de Wet et al. (2008) durchgeführt worden war, und zeigte, dass die verschiedenen Genregionen homogene Mutationsraten und damit ein ähnliches phylogenetisches Signal anzeigen. Die Kombination des Daten­satzes stellte also kein Problem dar.

Ergebnisse

Abb. 2. Unpigmentierte Konidien mit aufgebrochenem Py­knidium (Anilinblau-Lactophenol-Färbung).

Abb. 3. Reife, pigmentierte Konidien, teilweise bereits zweizellig.

Wie Tab. 1 zeigt, liegen die Längen-Werte des Belegs von Liguster innerhalb der Bandbreite des Isotyps von Montagne, die Sporenbreiten hingegen liegen darunter. Im Vergleich mit Belegen einiger Synonyme von D. mutila erkennt man, dass bei einer recht weiten Bandbreite der Konidiengrößen der Beleg vom Liguster (1) im Spektrum liegt (Tab. 1).

Abb. 4. Oberseite von PDA-Kulturen des Isolates CJK1 nach 4 Tagen bei Temperaturen von 10°C, 15°C, 20°C, 25°C und 30°C (im Uhrzeigersinn, links in der Mitte beginnend).

Abb. 5. Verfärbung des Myzels von PDA-Kulturen des Isolates CJK1von Hell zu Dunkel bei 25°C; nach 2 Wochen weiß-gräulich (rechts), nach 4 Wochen schwarz (links).

Tab. 2 veranschaulicht das Myzelwachstum bei unterschiedlichen Inkubationszeiten (IZ) und Inkubationstemperaturen (IT).

Das Myzelwachstum setzte beim Isolat CJK1 bei 5°C ein, um bis zum Optimum von 25°C anzusteigen. Ab 30°C nahm das Wachstum ab und bei 35°C war kein Wachstum mehr festzustellen. Die Mittelwerte der einzelnen Temperaturstufen wurden in EXCEL mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse verglichen (Abb. 6). Sie unterschieden sich signifikant (p = 0.05).

Abb. 6. Wachstum des Myzels des Isolates CJK1 bei unterschiedlichen Tem­peraturstufen auf PDA. Ein Durchmesser von 5 mm stellt das Aus­gangniveau des Wachs­tums dar. Die horizontale Achse zeigt die Anzahl der Inkubati­onstage. Die Linien ba­sieren auf den beobachteten Mittel­werten und die Fehler­balken stellen das 95%ige Konfidenzintervall dar.

Abb. 7. Infektionsstelle bei Ligustrum vulgare. Es sind deutlich die Verfärbungen des Gewebes zu sehen. Rund um die Inokulationsstelle haben sich bereits Fruchtkörper gebildet.

Die untere Grenze des 95%-Konfidenzintervalls lag bei beiden Pflanzenarten deutlich über diesem Grenzwert. Die mit CJK1 inokulierten Pflanzen unterschieden sich somit signifikant von der Kontrollgruppe hinsichtlich der Nekrosenlänge (p < 0.001, Mann-Whitney U-Test). Der Median liegt bei Ligustrum vulgare höher als der Median bei Prunus avium und die Werte bei Ligustrum vulgare streuen stärker (Abb. 8).

Abb. 8. Länge der Nekrosen bei Ligustrum vulgare und Prunus avium im Vergleich.

Bei Thuja occidentalis ‘Smaragd‘ war der Leittrieb in seiner Gesamtheit betroffen. Hier wurde die Symptomausprägung in die Kategorien „kein Zurücksterben“ und „Zurücksterben“ unterteilt. Die Triebe vertrockneten von der Impfstelle ausgehend oberhalb (Wipfeldürre), was mit einer Braunfärbung eingeleitet wurde. Da 3 Pflanzen des inokulierten Kollektives ausfielen (Trockenschäden), verblieben 12 Individuen in diesem Kollektiv. Am Ende des Versuches waren 7 dieser 12 Individuen oberhalb der Inokulationsstelle abgestorben, 5 zeigten keine Symptome. Bei den 5 Individuen der Kontrollgruppe waren ebenfalls keine Symptome sichtbar. Die statistische Absicherung der Pathogenität des Isolates CJK1 bei Thuja occidentalis ‘Smaragd‘ erfolgte mit einem χ²-bzw. Mann-Whitney U-Test:

Die Anteilswerte und Konfidenzintervalle innerhalb des Kollektivs der inokulierten Pflanzen waren:

Kein Zurücksterben: (5 von 12): 41,7% (CI: 19% –69%)

Zurücksterben: (7 von 12): 58,3% (CI: 32% –81%)

Abb. 9. Maximum parsimony Baum der Isolate von D. mu­tila aus dieser Arbeit und der GenBank. Zusätzlich in dieser Arbeit sequenzierte Arten sind in Fett­buchstaben beschriftet. Der Consensus-Baum aus 261 „most parsimonious“ Bäumen ist dargestellt. Der consistency index ist 0.872587 (0.780000), der retention index ist 0.902941 (0.902941), und der composite index ist 0.787895 (0.704294) für alle Stellen im Alignement bzw. für Parsimony-infor­mative Stellen (in Klammern). Die Prozentzahl der Bäume, in denen die assoziierten Taxa zusammen­clustern ist neben den Knoten dargestellt. Der MP-Baum wurde durch den Close Neighbor-Interchan­ge Algorithmus, bei dem die Anfangsbäume durch zufällige Anknüpfung der Sequenzen (mit 10 Wie­derholungen) ermittelt wurden. Lücken im Aligne­ment wurden als fehlende Daten für alle Individuen interpretiert. Von den insgesamt 511 Positionen im Alignement waren 80 für die Analyse informativ.

Bei ITS hat CJK1 100% Identität mit der als Hauptgruppe definierten Gruppe „B. stevensii/D. mutila“; in dieser Gruppe liegt auch das Isolat (CBS112553) welches von Alves et al. (2004) in deren Untersuchung verwendet und als Isotyp designiert wurde. Die Art D. africana ist eng verwandt mit D. mutila (Damm et al., 2007). Dies zeigt sich auch im ITS-Stammbaum. Zwei Isolate von D. mutila von Quercus agrifolia aus Kalifornien gruppieren sich sehr nahe an diese Art. Das Isolat von S. tumefaciens welches in die Untersuchung mit einbezogen worden war, ist nicht näher mit den anderen untersuchten Arten verwandt. Es konnte somit ausgeschlossen werden, dass es sich bei dem Erreger des Triebsterbens an Liguster um diesen, zunächst als Krankheitserreger an Liguster vermuteten Organismus handelt.

In Abb. 10 ist das Ergebnis der kombinierten Analyse nach der Arbeit von de Wet et al. (2008) dargestellt. Auch hier ist die Gruppierung des Isolates von Liguster eindeutig bei D. mutila/B. stevensii.

Abb. 10. Neighbour-Joining Baum basierend auf der Kom­bination der Genregionen ITS, ß-Tubulin und Aktin. Vergleichssequenzen aus de Wet et al. (2008). Abgebildet ist der Konsensus-Baum aus 1000 Bootstrap-Replikaten, Distanzen wurden nach der Kimura-2-Parameter-Methode berechnet. Zahlen zeigen die %-Anzahl der gesamten Bäume die die jeweilige Gliederung teilen. Der Maßstabs­balken gibt die Distanz zwischen den Sequenzen an (Basensubstitution/Posi­tion). Insgesamt wurden 798 Positionen von 42 Taxa in die Analyse einbe­zogen. Die Analyse wurde mit MEGA v5 durchgeführt.

Die weite Bandbreite der Sporenmaße von D. mutila (Literatur und Vergleichsuntersuchung der Herbarbelege) rechtfertigt die Einordnung des Pilzes vom Liguster von den Konidienmaßen her in die Art D. mutila.

Das im Wachstumsversuch ermittelte Temperaturoptimum stimmt mit dem von Úrbez-Torres et al. (2006) festgestellten überein.

Durch Sequenzanalysen der ribosomalen DNA sowie zwei weiterer nuklearer Genregionen erfolgte die Identifizierung von B. stevensii als die 2011 an Liguster aufgetretene Pilzart. Damit ist der Erstnachweis des Erregers an dieser Gehölzart erbracht. Allerdings steht eine taxonomische Bearbeitung von B. stevensii unter Einbeziehung der Typusbelege von bisher auf Ligustrum beschriebenen Diplodia-Arten noch aus.

Die enge Verwandtschaft zu D. pinea/Sph. sapinea ist deutlich in der 18S und ITS Sequenz zu sehen, dies wird auch von Smith und Stanosz (1995) bestätigt. Die Hauptgruppe von D. mutila in der phylogenetischen Auswertung, der auch das Isolat CJK1 von Liguster angehört, wird vor allem von Isolaten von Wein und Apfel gebildet, es sind jedoch auch Isolate von Prunus, Fraxinus, Citrus, Acer, sowie Ilex, Paris und Phoenix darunter. Diese Gruppe von Isolaten dürfte die am weitesten verbreitete sein und auch den größten Wirtspflanzenkreis aufweisen.

Neben der Hauptgruppe von D. mutila, der die Mehrzahl der Isolate angehört, wurden bei den Analysen auch 4 weitere Gruppen entdeckt, die teilweise auf starke Wirts­spezifität und kryptische Artbildung hindeuten.

Auch Zhou und Stanosz (2001a, 2001b) und Alves et al. (2004) bemerken, dass D. mutila noch starke Varia­tion in sich birgt, die noch aufgeklärt werden muss. Die vorliegende Arbeit hat dazu wichtige Erkenntnisse gebracht, an die in weiteren Untersuchungen angeknüpft werden kann. Die erste Untergruppe wird von 4 Isolaten gebildet, die alle von Esche (Fraxinus excelsior) aus Nordeuropa (Lettland, Litauen, Schweden) und den Niederlanden stammen. Der Erreger wurde unter anderem in den letzten Jahren sehr häufig im Zuge des Eschentriebsterbens erwähnt. Die primäre Ursache des Eschentriebsterbens ist der Pilz Chalara fraxinea (Kowalski, 2006). Eine Reihe von Pilzen ist an der Esche identifiziert worden, die verantwortlich für krebsartige Wucherungen und das Absterben von Triebspitzen sind. Am häufigsten waren: Alternaria alternata, Chalara spp., Cytospora ambiens, Diplodia mutila, Fusarium lateritium, Gloeosporidiella turgida, Phomopsis controversa und Phomopsis scobina (Kowalski und Lukomska, 2005; Heydeck et al., 2005). Es ist zu erwähnen, dass D. mutila sehr häufig in Studien mit dem Eschentriebsterben als Sekundärparasit bezeichnet wird. Diese Arbeit zeigt, dass die Isolate des Erregers an Fraxinus excelsior nicht gleich gesetzt werden können mit den Isolaten von D. mutila aus der Hauptgruppe.

Die zweite Untergruppe wird von zwei Isolaten von Quercus agrifolia aus Kalifornien gebildet. Diese Isolate zeigen hohe Sequenzhomologie mit einer relativ neu beschriebenen Art, D. africana (Damm et al., 2007), die bisher nur aus Südafrika bekannt war. Diese Isolate könnten D. africana zugerechnet werden, bzw. stellen sie eine eigene eng verwandte Art dar. Möglicherweise ist diese (oder sehr ähnliche Arten) also auch in anderen subtropischen Klimaten verbreitet.

Die dritte Gruppe wird von Isolaten gebildet, die einerseits von Esche in Europa sowie von Wein aus Kalifornien stammen. Auch diese Gruppe wurde durch die Bootstrapping-Werte stark unterstützt. Im Alignement der Sequenzen sind bei diesen Isolaten mehrere Insertionen zu bemerken, was auf relativ starke Divergenz zur Hauptgruppe schließen lässt.

Die vierte Untergruppe, die von nur einem Isolat von Pyrus communis aus Portugal gebildet wird, ist diejenige, die am stärksten von den übrigen abweicht und ebenfalls noch eingehender untersucht werden sollte. Wollenweber und Hochapfel (1941) beschreiben eine Varietät von D. mutila von Pyrus communis in Polen (Schlesien). Diese var. major soll größere Konidien als D. mutila haben und ähnelt damit D. africana. Auch hier wären weitere Untersuchungen insbesondere in Bezug auf diese 4. Untergruppen sicher lohnend. Diese vier Untergruppen waren sehr gut durch die Bootstrap-Werte unterstützt. Eingehende morphologische und weitere molekulare Untersuchungen sind nötig, um zu klären ob es sich dabei um eigene Arten handelt (kryptische Artbildung; vgl. Alves et al., 2004).

Diplodia mutila wird auch als Pathogen von Koniferen beschrieben (z.B. Juniperus scopulorum). Auch der Infektionsversuch in dieser Arbeit bestätigt die Pathogenität an Thuja. Allerdings sind in der Genbank bisher keine Vertreter der Art von Koniferen enthalten. de Wet et al. (2008) weisen darauf hin, dass es auch zu Verwechslungen zwischen D. cupressi, die nur an Koniferen vorkommt, und D. mutila gekommen sein könnte. So auch in der Arbeit von Alves et al. (2004): dort werden zwei Isolate von Juniperus fälschlich als B. stevensii bezeichnet, während es sich tatsächlich um D. cupressi handelt (Alves et al., 2006). Auch Verwechslungen mit D. pinea könnten vorkommen. Ob D. mutila tatsächlich spontan auch an Koniferen vorkommt, sollte noch eingehender untersucht werden.

Sphaeropsis tumefaciens, der Erreger eines Krebses an verschiedenen Citrus-Gewächsen sowie an Nerium und Ilex, ist offenbar nicht näher mit D. mutila und anderen Vertretern der Botryosphaeriaceae verwandt. Die nächsten Verwandten stammen offenbar aus der Gruppe der wenig untersuchten Capnodiales; Taxonomie und Systematik sind daher noch zu klären. Statt Sphaeropsis ist nach Denman et al. (2000) Diplodia zu verwenden; da es allerdings bereits eine Art Diplodia tumefaciens (Shear) Zalasky (an Pappel) gibt (Zalasky, 1964), ist der Name daher nicht eindeutig und bedarf dringend einer Revision.

Im Infektionsversuch erwies sich B. stevensii vom Liguster als pathogen an Ligusterpflanzen sowie an Pflanzen von Prunus avium, es entwickelten sich Rindennekrosen von einigen Zentimetern Länge. Weiterführende Literatur zur Pathogenität von B. stevensii an Prunus avium wurde nicht gefunden. Moret Benaset und Nadal Puig-Defabregas (1991) wiesen in Katalonien B. stevensii unter anderem auch an Prunus avium nach, es fehlen jedoch Hinweise auf die Pathogenität und die Symptomausprägung.

Bei Thuja occidentalis ‘Smaragd‘ löste die Inokulation Wipfelsterben aus: Auch zu dieser Pflanzenart fanden sich zur Symptomatik bei Befall mit B. stevensii in der Literatur keine Hinweise.

An Crataegus und Forsythia wurde in der vorliegenden Untersuchung mit dem B. stevensii – Isolat vom Liguster keine Pathogenität festgestellt. Dies ist insbesondere bei Weißdorn interessant, da B. stevensii beim nahe verwandten Apfel als Pathogen auftritt (Harmon, 2005).

Fußnoten: