Kontaminationswege und Nachweis von humanpathogenen Escherichia coli aus pflanzlichen Lebensmitteln

Contamination pathways and detection of human pathogenic Escherichia coli from plant foods

Lebensmittel pflanzlichen Ursprungs sind schon seit langem als Quelle von Krankheitsausbrüchen durch eine Vielzahl bakterieller Erreger (darunter auch Salmonella und E. coli) bekannt (Klepzig et al., 1999; Olaimat und Holley, 2012). Neuere Daten des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (CDC, 2015) geben einen aktuellen Überblick für die USA zu Krankheitsausbrüchen und damit assoziierte Lebensmittel. Für das Gebiet der EU waren nach Angaben der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) im Zeitraum 2008–2011 Lebensmittel nicht-tierischen Ursprungs an 10% der Ausbrüche, 18% der Erkrankungen und 5% der Todesfälle durch humanpathogene Mikroorganismen beteiligt. Auf der bakteriellen Erregerseite stehen hier Salmonellen und pathogene E. coli in erster Linie. (Anonymus, 2002a; EFSA, 2013).

Als verantwortliche Faktoren für die beobachtete Zunahme von Infektionen durch Verzehr pflanzlicher Lebensmittel wird zum einen die zunehmende Globa­lisierung des Handels mit Lebensmitteln genannt (Anonymus, 2002a; Bavaro, 2012; Olaimat und Holley, 2012). Zum anderen Produktionsverfahren, wie die Herstellung von verzehrfertigen Fertigprodukten durch mechanisches Zerkleinern (z.B. Schnittsalate, Rohkostsalate, Fertig­salate, Frischkostsalate, Mischsalate). Hierbei kommt es zu Kreuzkontaminationen im Produktionsprozess, und das Wachstum der Erreger wird durch das Austreten von pflanzlichen Säften aus den Schnittstellen begünstigt (Anonymus, 2002a; Franz und van Bruggen, 2008).

Diese Produktionsbedingungen und der Trend zu Fertiggerichten begünstigen die Vermehrung von entero­pathogenen Bakterien, die sich auf intakten Pflanzen nicht oder schlecht vermehren können (Pan und Schaffner, 2010). Ähnliche, die Bakterienvermehrung begünsti­gende Bedingungen liegen bei der Herstellung von Keimsprossen vor (Gandhi et al., 2001).

Hinzu kommt, dass der Trend Gemüse roh zu verzehren seit Jahren zunimmt (Anonymus, 2002a; Walsemann, 2005; Olaimat und Holley, 2012) und damit die Wahrscheinlichkeit steigt, sich über roh verzehrte pflanzliche Lebensmittel zu infizieren. Verbesserte Nachweismethoden für bakterielle Erreger tragen dazu bei, dass mehr durch Infektionserreger belastete Lebensmittel als solche auch erkannt werden (Franz und van Bruggen, 2008).

Mit Ausnahme der EHEC (enterohämorrhagische E. coli) O104:H4 Ausbruchsuntersuchung im Sommer 2011, bei der 1069 Proben von Gurken, Tomaten und Blattsalate auf EHEC getestet wurden (Anonymus, 2011a), werden in Deutschland pflanzliche Lebensmittel eher selten untersucht (Hartung et al., 2015). Untersuchungen im Nationalen Referenzlabor für Escherichia coli (NRL-E. coli) am Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) konnten zeigen, dass bisher vorliegende Methoden (§ 64 LFGB) zum Nachweis von EHEC aus Lebensmitteln für pflanzliche Lebensmittel ungeeignet sind, da diese Matrix an die Diagnostik andere Anforderungen stellt, als tierische Produkte (Tzschoppe, 2010). Für tierische Produkte bestehen bereits seit langem derartige Richtlinien (Anonymus, 2006).

Die Kontamination pflanzlicher Erzeugnisse mit humanpathogenen Bakterien wird generell unterschätzt, da die bisher entwickelten Routineverfahren besonders für den Nachweis geringer Keimzahlen nur bedingt geeignet sind (Yaron und Romling, 2014). Amtliche Richtlinien zur Identifizierung und Charakterisierung von EHEC und anderen Shiga-Toxin produzierenden E. coli (STEC) nach § 64 LFGB aus pflanzlichen Lebensmitteln werden seit 2012 vom Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) erarbeitet.

Landwirtschaftliche Nutztiere und Wild, einschließlich Vögel und Insekten sind die wichtigste Quelle für den Eintrag von pathogenen Enterobacteriaceen in die Umwelt, die von ihren natürlichen Trägern mit dem Kot ausgeschieden werden. Hierdurch kommt es zur weitläufigen Kontamination von Ackerböden, Oberflächenwasser, Brunnenwasser und landwirtschaftlichen Gerätschaften. Die Erreger können über lange Zeiträume von mehr als 100 Tagen auf den Pflanzen und in der Umwelt überleben (Fremaux et al., 2008; Yaron und Romling, 2014). Eine kontaminierte Umwelt dient wiederum als Infektionsquelle für Personen und Tiere, die ihrerseits die Erreger weiter verbreiten können. Durch Vögel und Insekten werden die Erreger über hunderte von Kilometern auf große geographische Räume verstreut, sodass auch in landwirtschaftlich nicht genutzten Gebieten mit ihrem Vorkommen gerechnet werden muss (Beutin und Fach, 2014).

Die Kontamination der Pflanze kann bereits auf dem Acker durch Düngung, Bewässerung, Insekten als Überträger und Kontamination mit Fäzes erfolgen. Die Anheftung und Besiedlung der Pflanze mit Salmonellen und pathogenen E. coli wird durch verschiedene bakterielle Faktoren wie Typ 3 Sekretionssystemeffektoren (T3SS), Flagellen, Fimbrien und Lipopolysacchride (O-Antigen) vermittelt (Berger et al., 2010; Saldana et al., 2011; Chitarra et al., 2014; Yaron und Romling, 2014). Hierbei bilden sich Biofilme, die das Überleben der Bakterien begünstigen (Schutzfunktion) und von den Pflanzen durch Waschen mit chloriertem Wasser und anderen antimikrobiellen Substanzen nicht effektiv entfernt werden können (Albrecht et al., 1994; Yaron und Romling, 2014). Untersuchungen zeigen, dass die Bakterien weniger über Aufnahme durch die Wurzel von den Pflanzen internalisiert werden, als über die Blätter, beispielsweise durch Berieselung mit bakteriell kontaminiertem Wasser (Sharma et al., 2009; Zhang et al., 2009).

Über die Spaltöffnungen der Blätter können die Bak­terien internalisiert werden (Berger et al., 2010). Die Aufnahme von Salmonellen und EHEC O157 in essbare Pflanzenteile wurde bereits für Tomaten, verschiedene Sorten von Keimsprossen, Gerste und Blattsalat nachgewiesen (Franz und van Bruggen, 2008). Die Kolonisation verschiedener Nutzpflanzen mit Salmonellen und E. coli O157 erfolgt bei relativ kurzer Expositionszeit, dabei wurden Zeiträume von 30 Sekunden bis vier Stunden genannt (Yaron und Romling, 2014). Die Erreger können über lange, für den Verzehr relevante Zeiträume (14 – > 200 Tage) auf der Oberfläche und intern auf den Pflanzen lebensfähig bleiben (Berger et al., 2010; Yaron und Romling, 2014). Über bakterielle Regulationsmechanismen, die die Kolonisation begünstigen, Resistenz gegen oxidativen Stress erzeugen und chemotaktische Mechanismen findet eine Anpassung der Erreger an den Wirt „Pflanze“ statt (Dublan Mde et al., 2014). Es ist noch ungeklärt, inwieweit bei der Kolonisation und Internalisierung der Bakterien zwischen verschiedenen Pflanzenspezies Unterschiede bestehen. Der Lebensraum (Rhizosphäre) und Teile der Pflanze (Phyllosphäre) stellen unterschiedliche Habitate für Mikroorganismen dar. In der nährstoffreichen Rhizosphäre werden 10⁶ – 10⁹ Bakterien/g Wurzelmaterial gefunden, in der nährstoff­armen und Umweltflüssen stärker ausgesetzten Phyllo­sphäre finden sich dagegen nur 10³ – 10⁷ Bakterien/g Blattmaterial (Hallmann et al., 2001). Über kultivierungsunabhängige Verfahren wurden für vier Pflanzenarten mittels eines Chloroplasten ausschließenden Primer Paares und quantitativer Real-Time PCR bakterielle 16S rDNA Kopienzahlen (cn) bestimmt (Rastogi et al., 2010). Für die Blattsalate Cichorium endivia und Lactuca sativa lag die ermittelte Bakterienzahl bei 6.85 ± 0.417 log cn g^–1 FM bzw. 6.75 ± 0.32 log cn g^–1 FM. Ähnliche Größenordnungen wurden an den Kräutern Thymus vulgaris (6.31 ± 0.69 log cn g^–1 FM) und Lepidium sativum (7.30 ± 0.08 log cn g^–1 FM) in der Phyllosphäre nachgewiesen (S. Ruppel, A.C. Scherwinski, unveröffentlicht).

Pseudomonaden und Enterobacter, die zur natürlichen Phytoflora zählen, haben nachgewiesen antagonistische Effekte auf Salmonellen und E. coli (Cooley et al., 2003; Yao et al., 2014). Die Mechanismen, die dabei eine Rolle spielen, sind nicht vollständig bekannt (Teplitski et al., 2011). Auf der anderen Seite haben Mikroorganismen und Pilze, die an Reifungs- und Verfallsprozessen der Pflanzen beteiligt sind, eine begünstigende Wirkung auf die Vermehrung von (pathogenen) Enterobacteriaceen wie Salmonellen und E. coli O157 (Teplitski et al., 2011). Für die Matrix vorgeschnittene Mischsalate konnte eine Reduktion der inokulierter EHEC bei den üblichen Lagerungstemperaturen (< 10°C) innerhalb der Mindesthaltbarkeitsgrenze beobachtet werden (Tzschoppe et al., 2012). Die Phytoflora nahm in diesem Zeitraum zu, allerdings blieb ungeklärt, welche Mechanismen bei der Reduktion der inokulierten EHEC im Einzelnen eine Rolle spielen (Tzschoppe et al., 2012).

Die Einhaltung von Kühltemperaturen hat einen limitierenden Effekt auf Verderb fördernde Bakterien und pathogene Erreger, wohingegen Aufbewahrung unter Schutzgas in dieser Hinsicht keinen Effekt zeigt (Nguyen-the und Carlin, 1994; Olaimat und Holley, 2012). Bei Kühl­temperaturen vermehrt sich die native bakterielle Flora (Enterobacteriaceen und Pseudomonaden) weiterhin, sodass Keimmengen von 10⁷/g auch innerhalb der Mindesthaltbarkeitsgrenze erreicht werden (Bomar, 1988; Albrecht et al., 1994; Lack et al., 1996; Klepzig et al., 1999; Tzschoppe, 2010; Tzschoppe et al., 2012). Raum­temperaturen um die 22°C begünstigen bereits das Wachstum von darmpathogenen Keimen. Bei diesen Temperaturen wurden für Salmonellen und enteropathogene E. coli Titeranstiege um 2 bis 3 Zehnerpotenzen inner­halb von 48 Stunden beobachtet. Damit werden Keimmengen erreicht, die die minimale Infektionsdosis für die Erreger weit übersteigen können (Bomar, 1988; Nguyen-the und Carlin, 1994). Allerdings wurden diese Untersuchungen mit einzelnen Pflanzenspezies gemacht und sind nicht generell auf alle Pflanzenspezies übertragbar (Nguyen-the und Carlin, 1994).

Auch andere pflanzliche Nahrungsmittel wie verschiedene Fruchtsorten, verarbeitete Früchte, Fruchtsäfte und Gemüse sind bereits im Zusammenhang mit Ausbrüchen (Salmonella, pathogene E. coli und andere Mikroorganismen) in Zusammenhang gebracht worden (Anonymus, 2002a; Berger et al., 2010). Für Früchte ist von besonderer Bedeutung, dass während des Reifeprozesses bis hin zum Verderb ein steigendes Risiko für eine Kontamina­tion mit enteropathogenen Bakterien besteht (Teplitski et al., 2011). Bei Pfirsichen und Pflaumen reichten Expositionszeiten von 30 sec bis zu einer Minute, um mit E. coli O157 und Salmonellen erfolgreich kolonisiert zu werden (Yaron und Romling, 2014). Aus diesen Befunden ergibt sich ein hohes Risiko für eine Kontamination (Eintrag durch Mensch, Umwelt und Verarbeitungsprozesse) von Früchten, deren Verarbeitungsprodukten und anderen roh verzehrten pflanzlichen Lebensmitteln entlang der Stationen von der Ernte über den Handel bis zum Verzehr (Olaimat und Holley, 2012).

Es ist bereits seit langem bekannt, dass Keimsprossen mit einem hohen Risiko für die Kontamination mit Salmonellen und pathogenen E. coli behaftet sind (Anonymus, 1999; Anonymus, 2002a). Die technischen Begebenheiten der Sprossenproduktion (Zeitdauer bis zur Auskeimung, Temperatur, Feuchtigkeit und Nährstoffe) begünstigen die Kontamination und die Proliferation von darmpathogenen Keimen, wie Salmonellen und pathogene E. coli, wobei Keimzahlen von bis zu 10¹¹KbE/g) erreicht werden (Taormina et al., 1999; Anonymus, 2002a; Sikin et al., 2013).

Durch die Auskeimung im wässrigen Milieu bricht die Samenschale als natürliche Barriere gegen Bakterien auf. Nährstoffe werden ausgeschieden und abhängig von der Temperatur können sich pathogene Enterobacteriaceen an die Keimlinge anheften und vermehren. In der gewerbs­mäßigen Produktion übliche Dekontaminationsverfahren zeigen dagegen keine oder nur mäßige Wirkung auf pathogene Bakterien (Taormina und Beuchat, 1999; Ding et al., 2013; Sikin et al., 2013).

Keimsprossen gelten daher seit langem als Lebensmittel, die mit hohem Risiko belastet sind (Anonymus, 2002a). Dementsprechend wurde auch über eine Vielzahl von Ausbrüchen an bakteriellen Infektionen durch Sprossenverzehr berichtet (Anonymus, 1999; Anonymus, 2002a; Berger et al., 2010). Für die USA werden 10% der durch pflanzliche Nahrungsmittel verursachten Aus­brüche Keimsprossen zugeordnet (Sikin et al., 2013). Die weltweit bisher größten Ausbrüche mit EHEC (EHEC O157:H7 in Japan 1996, EHEC O104:H4 in Deutschland 2011) konnten auf EHEC-kontaminierte Keimsprossen zurückgeführt werden (Michino et al., 1999; Beutin und Martin, 2012).

Nach eigenen Untersuchungen mit Bockshornklee­samen hängt die Vermehrung zugesetzter pathogener E. coli während der Auskeimung von Sprossen aus den Samen stark von der Temperatur ab, bei der die Auskeimung der Sprossen erfolgt. Die gewerbsmäßige Sprossenproduktion erfolgt bei Temperaturen zwischen 32 – 35°C für 4 – 12 h (Einweichen) und 25 – 30°C für 4 – 14 Tage (Auskeimung) (Friedrich et al., 2011), wodurch nach eigener Erfahrung die Vermehrung von (pathogenen) E. coli extrem begünstigt wird (L. Beutin, unveröffentlicht). Hinzu kommt, dass schon eine Kontamination des für das Einweichen der Samen verwendeten Quell­wassers mit geringen Mengen an pathogenen E. coli (< 100 KbE (Koloniebildende Einheiten, colony-forming unit CFU) auf 150 ml Leitungswasser für 6 h Einwirkungszeit) eine Anheftung der Keime an die Samen stattfindet, die nach vier Tagen Keimung auf den Bocks­hornkleesprossen mit der beschriebenen PCR-Methode (Tzschoppe et al., 2012) nachgewiesen werden können (L. Beutin, unveröffentlicht). Daraus folgt, dass auch nur eine geringe Kontamination des zur Quellung der Samen verwendeten Wassers mit pathogenen E. coli ausreicht, um eine massive Vermehrung dieser Keime auf den aus den Samen gezüchteten Keimsprossen zu gewährleisten. Sinnentsprechend wird von der Deutschen Gesellschaft für Krankenhaushygiene (DGKH) die Verwendung hygie­nisch einwandfreien Wassers für die Sprossenproduk­tion empfohlen (DGKH, 2012). Die Bedeutung der Hygiene wurde beim EHEC O104:H4 im Sommer 2011 Ausbruch offensichtlich, da sich unter den in der Sprossenproduktion beschäftigten Mitarbeitern auch asympto­matische Ausscheider von EHEC O104:H4 befanden (Adolphs et al., 2012; DGKH, 2012).

Die Assoziation von tierischen und pflanzlichen Nahrungsmitteln mit Mikroorganismen ist produktionsbedingt unumgänglich. Bei pflanzlichen Nahrungsmitteln hat die assoziierte Phytoflora zudem eine Schutzfunktion gegen pathogene Enterobacteriaceen wie E. coli und Salmonellen (Cooley et al., 2003; Teplitski et al., 2011; Gu et al., 2013; Yao et al., 2014). Pflanzenproduktion in Abwesenheit der natürlichen Phytoflora (beispielsweise auf sterilem Substrat) begünstigt die Besiedlung der Pflanze durch pathogene Enterobacteriaceen wie Salmonellen und E. coli O157 (Cooley et al., 2003; Gu et al., 2013). Die Schutzfunktion durch die Phytoflora ist jedoch nicht absolut, sodass auch bei erntefrischen Pflanzen durchaus mit geringen Keimmengen an (pathogenen) E. coli und Salmonellen gerechnet werden muss. Dagegen können technisch prozessierte pflanzliche Lebensmittel (Schnittsalate, Sprossen) durchaus höhere Keimmengen an humanpathogenen Enterobacteriaceen enthalten, ebenso wie überreife und im Verderb befind­liche Feldfrüchte (Teplitski et al., 2011).

Zur Untersuchung der tatsächlichen Belastung von zum Rohverzehr vorgesehenen pflanzlichen Lebensmitteln mit pathogenen Enterobacteriaceen müssen Methoden eingesetzt werden, welche die Erkennung auch geringer Mengen (< 10 KbE/25 g) von pathogenen E. coli und Salmonellen gewährleisten, da die für eine Infektion nötige Keimzahl für EHEC O157:H7 auf unter 700 KbeE ermittelt wurde (Tuttle et al., 1999; Anonymus, 2012). Die von der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (Anonymus, 2011b) vorgeschriebenen Richt- und Warnwerte für E. coli für Mischsalate 1x10²/g beziehungsweise 1x10³/g (nach Revision 2014 nunmehr 1x10¹/g beziehungsweise 1x10²/g) bieten für die Infektionsprophylaxe nur eingeschränkte Sicherheit, da die potenzielle Anwesenheit pathogener E. coli nicht mit der Menge der nachgewiesenen Bakterien korreliert und die Bedingungen für eine mögliche Proliferation der Keime im Lebensmittel nach Verkauf an den Konsumenten (Unterbrechen der Kühlkette, Zeit bis zum Verzehr) sehr unterschiedlich sein können. Im Gegensatz zu anderen Keimen gelten für EHEC auch keine Toleranzgrenzen, sodass die Nachweismethoden geeignet sein müssen, die Abwesenheit des Erregers in der jeweiligen Menge (in der Regel 25 g) des geprüften Untersuchungsmaterials zu gewährleisten, wie es auch für Salmonellen verlangt wird (Anonymus, 2011b).

Abb. 1. Nachweis des enteroaggregativen EHEC O104:H4 durch einen multiparametrischen Test in der quanti­tativen Real-Time PCR.

Bei der Wahl der Anreicherungsmethode muss beachtet werden, dass pathogene Enterobacteriaceen auf Pflanzen, die nicht ihrem natürlichen Habitat entsprechen, einem physikalisch-chemischen Stress durch die Faktoren UV-Strahlung, Austrocknung, pflanzliche Abwehrmechanismen, kompetierende Mikroorganismen und Nährstoffmangel unterliegen. Gestresste Keime sind jedoch nicht immer direkt auf Selektivmedien, die Hemmstoffe enthalten, wie beispielsweise modifizierte Tryptose-Soya-Bouillon (mTSB), (enthält Gallensalze und Novobiocin), und für die Untersuchung tierischer Lebensmittel empfohlen werden, kultivierbar (Anonymus, 2002b; Anonymus, 2006; Jahn et al., 2008; Beutin und Fach, 2014). Ähnliche das Wachstum hemmende Effekte wurden auch auf tellurithaltigen Nährböden, die zur Anreicherung von EHEC verwendet werden, wie CT-SMAC und CHROMagar-STEC^® beobachtet (Beutin und Tzschoppe, 2012). Das Ausbleiben von Vermehrung bei prinzipiell lebensfähigen Keimen wird auch als VBNC (viable but non-culturable) bezeichnet (Ramamurthy et al., 2014; Aurass et al., 2011). Diese Bezeichnung trifft jedoch nicht ganz zu, da die Keime nach Stresserholung, beispielsweise durch mindestens 6 h Anreicherung in schwach selektiven oder unselektiven Medien wie Bril­liantgrün-Galle-Laktose Bouillon (BRILA) oder gepuffertem Peptonwasser durchaus in der Lage sind, auch auf Selektivnährböden zu wachsen.

Nach der publizierten Methode (Tzschoppe et al., 2012) werden für die Untersuchung pflanzlicher Lebensmittel 25 g Untersuchungsmaterial mit 225 ml BRILA oder BPW homogenisiert und mindestens 6 h bei 37°C schüttelnd inkubiert (1. Anreicherungsschritt). Danach werden 0,1 ml Aliquotmengen der Anreicherungen auf E. coli Indikatormedien wie TBX Agar und EHEC-Selektiv­medien wie z.B. Chromagar-STEC ausplattiert und die beimpften Platten 20 h bei 44°C bebrütet (2. Anreicherungsschritt). Die hohe Bebrütungstemperatur hat einen Hemmeffekt auf das Wachstum der psychrophilen Phytoflora (Tzschoppe et al., 2012). Durch die Wahl der Selektivnährböden und die Bebrütungstemperatur findet eine Doppelselektion zum Vorteil von (pathogenen) E. coli statt.

Durch die zweite Anreicherung auf festen Nährböden können auch geringe Mengen Zielkeime erfasst werden. Hierbei konnten zwei KbE EHEC in einem Hintergrund von 50 000 KbE anderer Keime nachgewiesen werden (Beutin et al., 2009, Tzschoppe et al., 2012). Durch die Bildung von Mikrokolonien beim 20 h Wachstum auf TBX-Agar werden die Zielkeime zu einer Menge vermehrt, die ihre gezielte Erkennung in der quantitativen real-time PCR (qPCR) erlaubt (> 10 Kopien der Ziel­sequenzen). Aus künstlich mit EHEC beimpften Proben vorgeschnittener Mischsalate konnten mit dieser Methode Keimmengen von < 10 KbE/25 g Mischsalat nachgewiesen werden (Tzschoppe et al., 2012). Als Zielsequenzen zur Identifizierung von EHEC wurden Detektoren für die Gene für Shigatoxin (stx1, stx2) Intimin (eae), Enterohämolysin (ehlyA), sowie Gene der O-Antigen bestimmenden Sequenzen (wzx, wzy u.a.) entwickelt und heran­gezogen (Bugarel et al., 2010; Tzschoppe et al., 2012).

Für die Isolierung der EHEC aus den Mischsalatproben erwies sich TBX-Agar als sehr gut geeignet, da auf diesem Nährboden Medium ß-D-Glucuronidase produzierende E. coli blau angefärbt werden und sich somit gut von den weißlichen bis gelben Kolonien der übrigen Flora abheben. Produktion von ß-D-Glucuronidase liegt bei 94% der E. coli Bakterien vor. Bei der Plattierung entsprechender Verdünnungen des flüssigen Anreicherungsmediums auf TBX-Agar können daher die blau erscheinenden Einzelkolonien der Zielkeime gut identifiziert und isoliert werden (Beutin und Tzschoppe, 2012; Tzschoppe et al., 2012). Eine ähnliche Methode, die einen nicht selektiven 5 h Anreicherungsschritt, qPCR Detektion von EHEC Markern und Selektivmedien beinhaltet, wurde als erfolgreich zur Kultivierung von EHEC O157 aus Koriander beschrieben (Yoshitomi et al., 2012).

Allerdings bieten die bisher für die Diagnostik von pathogenen E. coli entwickelten Indikator- und Selek­tivnährböden keine absolute Sicherheit, um alle Keime eines Pathovars wie Shigatoxin-bildende E. coli (STEC) zu erfassen (Beutin und Fach, 2014). Die phänotypischen Eigenschaften können bei einzelnen Vertretern der E. coli Pathovare STEC und EHEC, aber auch bei enterotoxi­schen (ETEC), enteropathogenen (EPEC), enteroinvasiven (EIEC) und enteroaggregativen (EAEC) E. coli sehr unterschiedlich sein und unterscheiden sich häufig nicht von avirulenten E. coli. (Kaper et al., 2004). Die Weiterentwicklung spezifischer Nährböden zur Erkennung und Isolierung pathogener Erreger aus Mischkulturen, wie aus Lebensmitteln, muss daher vorangetrieben werden.

Auch bei Sprossen setzt sich die Phytoflora über­wiegend aus Pseudomonaden und Enterobacteriaceen zusam­men (Piernas und Guiraud, 1997; Anonymus, 1999). In einer Untersuchung an Reissamen zeigte die natürliche mikrobielle Flora eine lange Persistenz, mit einem Rückgang von nur zwei Logstufen nach 277 Tagen Aufbewahrung bei Raumtemperatur (Piernas und Guiraud, 1997). Für Salmonellen wurden Überlebenszeiten von mehreren Monate auf Luzernesamen nachgewiesen (Anonymus, 1999).

Nach eigenen Untersuchungen, die im Rahmen des EHEC O104 Ausbruchs an Keimsprossen vorgenommen wurden, zeigte sich eine höhere Temperaturresistenz der mit den Sprossen assoziierten Phytoflora, als bei Mischsalaten. Für Sprossen erwies sich die Anreicherung bei 44°C daher als weniger selektiv (L. Beutin, M. Tzschoppe, unveröffentlicht), als es bei den Mischsalaten der Fall war (Tzschoppe et al., 2012). Möglicherweise hängt dies mit den gewerbsmäßigen Produktionsverfahren für die Sprossenkeimung zusammen, die bei höheren Temperaturen erfolgen (25 – 30°C), als die Kultivierung von Salat (Piernas und Guiraud, 1997; Friedrich et al., 2011). Somit findet schon bei der Sprossenkeimung eine Selektion auf Keime mit einer höheren Temperaturtoleranz statt.

Während der Keimung der Sprossen aus den Samen vermehrt sich die damit assoziierte Phytoflora zu hohen Mengen (10⁶ – 10⁹ KbE/g) (Anonymus, 1999). Auch für thermotolerante Coliforme und Enterococcen konnte nach zwei Tagen Sprossung bei 30°C ein Anstieg von bis zu sechs Logstufen beobachtet werden (Piernas und Guiraud, 1997). Vergleichbare Vermehrungsraten zeigten sich während der Sprossung bei pathogenen Mikro­organismen wie B. cereus, Salmonellen und EHEC O157 (Anonymus, 1999).

Voruntersuchungen im Nationalen Referenzlabor für E. coli am Bundesinstitut für Risikobewertung konnten zeigen, dass in mehr als 50% der Proben E. coli nur nach mikrobiologischer Anreicherung (s.o.) überhaupt nachweisbar ist und direkt kulturell erfassbare Mengen von ≥ 100 KbE/g nur bei 12% der Proben vorkommen (Tzschoppe, 2010). In anderen Untersuchungen zeigten sich bei der Belastung von verschiedenen Pflanzen mit E. coli erhebliche Mengenunterschiede. Diese erstreckten sich über einen Bereich von vier Potenzstufen (Arthur et al., 2007; Bohaychuk et al., 2009). Das Vorhandensein von pathogenen Vertretern der Spezies E. coli ist nicht unbedingt abhängig von der Gesamtmenge der vorhandenen E. coli, (Tuttle et al., 1999), sodass auch gering kontaminierte Proben durchaus pathogene E. coli ent­halten können. Die von der DGHM publizierten Richt- und Warnwerte (Anonymus, 2011b) zur Beurteilung von Lebensmitteln bieten daher keine Garantie auf Abwesenheit von pathogenen E. coli bei mikrobiologisch unauffälligen Proben.

Aus diesen Erkenntnissen ergibt sich zwingend die Notwendigkeit einer mikrobiologischen Anreicherung um pflanzliche Lebensmittel auf Vorhandensein von (pathogenen) E. coli effizient untersuchen zu können. Matrix-spezifische, methodische Verbesserungen sind in erster Linie bei der noch effizienteren Anreicherung der Zielkeime, bzw. der Hemmung der Matrix-typischen Begleitflora zu sehen. Dies betrifft vor allem Sprossen, da hier produktionsbedingt mit einer thermophilen Begleitflora zu rechnen ist. Die mit angereicherte Begleitflora hat nach eigenen Untersuchungen auf die Detektion der Zielkeime mit Real-Time PCR-Methoden keinen erheb­lichen Einfluss, die Detektion wird aber durch Ver­wendung von kommerziell verfügbaren DNA-Extraktions- und Purifika­tionskits verbessert (Beutin et al., 2009; Tzschoppe et al., 2012; Beutin und Fach, 2014).

Für den Nachweis von EHEC aus verschiedenen Untersuchungsmaterialien wurde bereits eine Reihe von PCR-Methoden beschrieben und eingesetzt (Beutin und Fach, 2014). Für die EU ist seit 2012 eine ISO-Norm zur Detektion von EHEC mittels qPCR aus Lebensmitteln etabliert (Anonymus, 2012). Im Rahmen der Untersuchungen am NRL-E.coli des BfR wurden für die spezifische Erkennung von EHEC und EHEC O104 im NRL-E.coli bereits TaqMan^® Real-Time PCR-Detektorsysteme (Primer und Sonden) entwickelt, mit welchen die Virulenzmerkmale (stx1, stx2, eae, ehlyA und nleB) und somatische Antigene (O- und H-Antigen) der wichtigsten EHEC-Gruppen (O26:H11, O91:H21, O103:H2, O104:H4, O111:H8, O113:H21, O121:H19, O145:H25/H28 und O157:H7) erfasst werden können, jedoch wurden noch nicht alle in die ISO-Norm aufgenommen (Beutin et al., 2009; Bugarel et al., 2010; Tzschoppe et al., 2012; Beutin et al., 2015a; Beutin et al., 2015b). Die qPCRs erwiesen sich als geeignet EHEC aus Mischsalatproben nachzuweisen, die mit < 10 KbE STEC beimpft worden waren (Tzschoppe et al., 2012; Beutin et al., 2015b).

Eine Weiterentwicklung von qPCR Detektoren, die Virulenzfaktoren und somatische Antigene von humanpathogenen E. coli (EHEC, STEC, EPEC, EIEC, EAEC und ETEC) erkennen, ist daher notwendig, um diese Erreger aus Untersuchungsmaterial sicher identifizieren und isolieren zu können. Im Vordergrund steht hier die molekulare Erkennung von pathogenen E. coli durch Nachweis der somatischen Antigene (O- und H-Antigen) durch qPCR-Verfahren. Die Kombination der O:H Antigene mit den entsprechenden Virulenzmerkmalen ergibt eine molekulare Signatur (Shiga-Toxine plus Serotyp wie z.B. O157:H7, O26:H11 etc.), durch welche die verschiedenen Erregertypen durch genetischen Nachweis erfasst werden können. Dieses Verfahren ist erheblich schneller als der Nachweis durch Isolierung und phänotypische Charakterisierung der Isolate. Das Verfahren ist von besonderer Bedeutung für verderbliche Lebensmittel, die in kurzer Zeit auf mögliche Kontaminationen untersucht werden müssen.

Mit der notwendigen Anreicherung der Zielkeime aus dem Untersuchungsmaterial „Pflanze“ erhöhen sich auch die Hürden bei der Isolierung von (pathogenen) E. coli aus den Proben, da die Menge der Begleitflora bei Anreicherung ebenfalls zunimmt und Enterobacteriaceen der Phytoflora häufig phänotypische Merkmale ausprägen, die für den kulturellen Nachweis von E. coli allgemein verwendet werden (ähnliche Morphologie, Laktosespaltung, Resistenz gegen Gallensalze). Daher ist die Entwicklung von qPCR-Verfahren, welche speziesspezifische Sequenzen der Zielkeime (hier E. coli) anzeigen, erforderlich, um geringe Kontaminationsmengen, die unterhalb der mikrobiologischen Nachweismöglichkeiten liegen, anzuzeigen. Dies hat den Vorteil, dass mit E. coli belastete Proben schnell erkannt und nur diese mit dem Einsatz spezifischer qPCR-Detektoren sofort auf pathogene E. coli geprüft werden können.

Zu diesem Zweck müssen Sequenzen für Gene ermittelt werden, die nach bisheriger Kenntnis allein der Spezies E. coli zuzuordnen sind und nicht bei Bakterien, die zur natürlichen Flora von pflanzlichen Lebensmitteln zählen, vorkommen. Idealerweise sollten diese in einer Kopie pro Zelle vorliegen. Entsprechende Sequenzen (beispielsweise von für den Zellhaushalt (housekeeping) benötigten Gene) müssen daraufhin untersucht werden, ob sie hinreichend konserviert sind, um als Zielsequenz für qPCR-Assays zu fungieren, mit deren Hilfe ein Nachweis von idealerweise sämtlichen Vertretern von E. coli vorgenommen werden kann.

Zur Evaluierung eines solchen generischen E. coli Detektionssystems muss nach Entwicklung entsprechender Sonden eine repräsentative Stammsammlung von pathogenen und apathogenen E. coli Stämmen untersucht werden. Hierzu müssen Referenzstämme (O- und H-Antigene) sowie eine repräsentative Anzahl Stämme verschiedener E. coli Pathovare hinzugezogen werden. Als Negativkontrollen sind Isolate der Phytoflora einzusetzen. qPCR Detektoren, die in der Lage sind sämtliche E. coli Vertreter aus diesen Stammkollektiven spezifisch zu erkennen, können dann in einem zweiten Schritt zum Nachweis von E. coli in natürlich und artifiziell kontaminierten pflanzlichen Lebensmitteln verwendet werden. Für obligat humanpathogene Erreger, wie beispielsweise Salmonellen, kann der generische Nachweis über entsprechende qPCR Detektoren, gegebenenfalls schon genügen.