Pre-breeding bei der Kartoffel (Solanum tuberosum) zur Verbesserung der Resistenz gegen Phytophthora infestans

Pre-breeding of potato (Solanum tuberosum) to improve resistance against Phytophthora infestans

Journal für Kulturpflanzen, 72 (12). S. 577–585, 2020, ISSN 1867-0911, DOI: 10.5073/JfK.2020.12.03, Verlag Eugen Ulmer KG, Stuttgart

Kontaktanschrift

Johanna Blossei, Julius Kühn-Institut (JKI) – Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen, Institut für Züchtungsforschung an landwirtschaftlichen Kulturen, Rudolf-Schick-Platz 3 a, 18190 Sanitz, OT Groß Lüsewitz, E-Mail: johanna.blossei@julius-kuehn.de

Zur Veröffentlichung angenommen

2. November 2020

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Einleitung

Nach wie vor gehört die Kartoffel (Solanum tuberosum L.) zu den wichtigsten Nahrungspflanzen weltweit. Dennoch ist ihre Ertragsstabilität vor allem durch Krankheiten wie die Kraut- und Knollenfäule (Abb. 1–4), hervorgerufen durch den Erreger Phyto­phthora infestans (P.i.), gefährdet. Bislang mangelt es trotz jahrzehntelanger Forschung an Sorten, welche die zahlreichen für Kartoffeln vermarktungsrelevanten Eigen­schaften mit einer hinreichend hohen und dauerhaften Widerstandsfähigkeit gegen P. infestans vereinen würden. Im Jahr 2019 waren in Deutschland sieben Sorten mit der Boniturnote 3 (Noten von 1 (geringe Anfälligkeit) bis 9 (hohe Anfälligkeit)) für den konventionellen Anbau und eine Sorte mit der Note 4 für den ökolo­gischen Anbau registriert (Bundessortenamt, 2019). Die Züchtung auf P.i.-Resistenz wird dadurch erschwert, dass Resistenzen gegen Krautfäule einerseits und Knollen­fäule andererseits nach bisherigen Erkenntnissen unabhängig voneinander vererbt werden (Mayton et al., 2010). Im letzten Jahrhundert gab es einige vielver­sprechende Ansätze für die Nutzung sogenannter R-Gene gegen Krautfäule, die jeweils eine hohe Resistenzausprägung ihrer Träger bedingten. Für diesen qualitativ ausgeprägten Typ der Resistenz sind insgesamt 11 R-Gene, die aus der Wildart S. demissum stammen und in die Kulturkartoffel eingekreuzt wurden, beschrieben worden (Black et al., 1953; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1969). Nachdem inzwischen diese Resistenzen jedoch alle von entsprechenden Pathotypen des sehr anpassungs­fähigen Erregers gebrochen worden sind (Collins et al., 1999; Hein et al., 2009), steht heute der quantitativ vererbte Typ der Resistenz im Fokus der Forschung, der durch die Beteiligung mehrerer bis vieler Gene mit jeweils unvollständiger Resistenzwirkung und längere Beständigkeit der Gesamtwirkung gegenüber der Pathogenpopulation gekennzeichnet ist. Am Julius Kühn-Institut (JKI) in Groß Lüsewitz wurden explizit für den ökologischen Anbau, bei dem die Bekämpfung von P.i. aufgrund der geltenden Beschränkung im Einsatz von Kupferpräparaten auf maximal 6 kg Cu²⁺ je Hektar und Jahr besonders schwierig ist (Verordnung (EG) Nr. 889/2008), im Rahmen eines BÖLN-Projekts (2810 OE 121) von 2012 bis 2018 ältere und jüngere Pre-breeding-Stämme des JKI hinsichtlich ihrer Resistenz- und Qualitätseigenschaften untersucht. Zudem wurde anhand von Sorten und Zuchtstämmen eine genomweite Asso­ziationsstudie durchgeführt, um QTL und entsprechende Marker für die quantitative P.i.-Resistenz der Zucht­stämme zu identifizieren.

Abb. 1. Gegen Krautfäule anfäl­lige und resistente Stämme im Vergleich vier Wochen nach der Inokulation mit P. infestans.

Abb. 4. Knollenfäulebefall im Scheibentest sechs Tage nach der Inokulation mit P. infestans. Die Scheiben aus Reihe eins und drei stammen von anfälligen Genotypen, dagegen sind in Reihe zwei Scheiben eines resistenten Genotyps gezeigt.

Abb. 2. Krautfäulebefall im Blatttest sechs Tage nach der Inokulation mit P. infestans. Die fünf Blätter der ersten Reihe stammen von einem re­sistenten Genotyp, die Blätter der Reihen zwei und drei entstammen hoch anfälligen Genotypen.

Abb. 3. Knollenfäulebefall an einer ganzen Knolle eines anfälligen Genotyps 14 Tage nach der Inokulation mit P. infestans mithilfe des Tauchtests.

Material und Methoden

Feldprüfung. Die Erfassung des Krautfäulebefalls erfolgte in einer vollständig randomisierten Blockanlage mit je zwei Wiederholungen à fünf Pflanzen je Stamm bzw. Sorte. Als Windschutz diente ein Mantel aus Hanfpflanzen. Zum Blühende der Sorte ‘Adretta‘ wurde jeweils eine Pflanze je Versuchsparzelle mit 5 ml einer P.i.-Suspen­sion verschiedener Pathotypen inokuliert, deren Zusammensetzung jedes Jahr mit neu gesammeltem Erregermaterial ergänzt wurde (1,2 × 10⁴ Sporangien/ml, Darsow, 2008). Anschließend erfolgte die Bonitur des Befalls in Prozent befallener Krautfläche jeder Parzelle unter Ausschluss der inokulierten Pflanze alle drei bis vier Tage, bis ein Befall von 100 % erreicht war, bzw. bis zur Abreife des jeweiligen Stammes. Anhand dieser Bonituren wurden rAUDPC-Werte (relative Area Under Disease Progress Curve; Fry, 1978; Colon, 1994) berechnet. Da die Krautfäuleresistenz häufig in Zusammenhang mit einer späten Abreife steht, wurden die rAUDPC-Werte anschließend nach Truberg et al. (2009) reifekorrigiert und als ΔrAUDPC-Werte dargestellt.

Einzelblatttest. Kurz vor der Inokulation im Feldversuch wurden jeweils fünf Blätter verschiedener Pflanzen eines Stammes entnommen und im Labor je 20 μl P.i.-Suspension auf die Blattunterseite getropft. Nach 24 h wurden die Blätter gedreht und für weitere fünf Tage bei 16°C, 95 % relativer Feuchte (RF) und 150 Lux inkubiert. Die Bonitur erfolgte anhand der nekrotisierten Blattfläche und der Mycelbildung auf der Blattunterseite (Tab. 1).

Tauchtest. Beim Tauchtest wird die Widerstandsfähigkeit der gesamten Knolle gegenüber Knollenfäule ermittelt. Dafür wurden je Stamm 15 Knollen in eine P.i.-Suspen­sion (2000 Sporangien/ml) getaucht und für 24 h in Dunkelheit bei 19°C/100 % RF inkubiert. Anschließend erfolgte eine 14-tägige Inkubation bei 16°C/85 % RF in Dunkelheit. Der Befall mit Knollenfäule wurde einzel­knollenweise erfasst und als Mittelwert je Stamm zusammengefasst (Tab. 2). Knollen, die keinen oder sehr geringen Befall (Note 2) zeigten, wurden nach 14 Tagen erneut bonitiert und gingen mit halber Gewichtung in den Index ein (Darsow, 2008). Diese zweite Bonitur diente dem Auffinden von Knollen, die bei der ersten Boni­tur so schwach befallen waren, dass der Befall nicht zu erkennen war. Um diesen späten und im Lager deutlich weniger gefährlichen Befall nicht zu überwerten, erfolgte die Gewichtung im Index mit dem Faktor 0,5.

Scheibentest. Um auch die Resistenzeigenschaften des Knollenmarks zu bewerten, wurde ein Scheibentest zu zwei Zeitpunkten mit vier Knollen je Stamm und Kon­zentrationsstufe durchgeführt. Von jeder Knolle wurde jeweils eine Scheibe an beiden Terminen mit je 20 μL einer niedrig (1.900 Sporangien/ml) bzw. einer hoch (15.000 Sporangien/ml) konzentrierten P.i.-Suspension inokuliert. Nach 24 h wurden die Scheiben gedreht und anschließend für weitere fünf Tage bei 16°C/95 % RF inku­biert. Für die Bonitur wurden die Scheiben mit jener P.i.-Konzentration gewertet, die eine Differenzierung des Befalls ermöglichte (Tab. 3).

Die Auswertungen der Laboruntersuchungen wurden neben den ΔrAUDPC-Werten für die Selektion von geeigneten Zuchtstämmen verwendet. Es wurde zudem geprüft, ob die Ergebnisse der verschiedenen Tests nach Pearson miteinander korrelieren. Prüfglieder, die sowohl in der Feldprüfung als auch in den Labortests eine hinreichende P.i.-Resistenz zeigten (durchschnittliche Boniturnoten < 5, ΔrAUDPC-Werte < 0), wurden im dritten Versuchsjahr auch hinsichtlich ihrer Speiseeignung untersucht (Daten unveröffentlicht).

Die Heritabilität des Merkmals ΔrAUDPC wurde nach Holland et al. (2003) berechnet.

Um molekulare Marker für die quantitative P.i.-Resistenz der JKI-Zuchtstämme zu identifizieren, wurde von 265 ausgewählten Stämmen und Sorten Blattmaterial entnommen und nach der CTAB-Methode (Stein et al., 2001) DNA extrahiert.

Anschließend erfolgte die Genotypisierung mit der DArTSeq Plattform (Erhalt von DArT und SNP Markern) durch Diversity Arrays Technology Pty Ltd, Canberra, Australien (https://www.diversityarrays.com/). Marker mit einer Minor-Allelfrequenz < 5 % oder einem Anteil an doppelten Nullallelen > 20 % wurden nicht berücksichtigt. Fehlende Markerdaten wurden mit der K-Nearest Neighbours-Methode ersetzt (Batista & Monard, 2002).

Für die Assoziationsstudie wurden LS-Means (Least Square Means) der ΔrAUDPC-Werte berechnet und mit den Daten der Genotypisierung als Alleldosis in R mit dem Modell „Diplo-additive“ (Paket „GWASpoly“ nach Rosyara et al., 2016) verrechnet.

Ergebnisse

In Abbildung 5 sind Boxplots von 103 Prüfgliedern der Jahre 2015–2017 in ihren ΔrAUDPC-Werten und ihren Reifegruppen im Vergleich gezeigt. Negative ΔrAUDPC-Werte (unterhalb der roten Linie) weisen einen beson­ders niedrigen reifekorrigierten Krautfäulebefall auf. Der Vergleich zeigt, dass der überwiegende Teil der JKI Stämme deutlich geringer befallen wurde als die meisten zugelassenen Sorten und Zuchtstämme anderer Herkunft und zudem ein großer Teil der relativ resistenten JKI-Stämme der frühen bis mittelfrühen Reifegruppe ange­hörte. Von den Sorten zeigten mit wenigen Ausnahmen diejenigen einen geringen Befall, die spät abreiften (Abb. 5).

Abb. 5. ΔrAUDPC-Werte und Reifeboniturnoten von Sorten und Zuchtstämmen im Mittel von drei Jahren. Die Boxplots zeigen jeweils den Median (dicke waagerechte Linie), das obere und untere Quartil (dünne waa­gerechte Linien) sowie Minimum und Maximum (Ende der Whisker) unter Ausschluss der Ausreißer. In Rot ist die Nulllinie dargestellt.

Auch die Ergebnisse der Labortests wiesen große Unter­schiede zwischen den Sorten und Zuchtstämmen auf. Bei sechs Stämmen war eine besonders geringe Ausbreitung der Kraut- und Knollenfäule zu beobachten. Zugleich konnten diese Stämme frühen bis mittelfrühen Reifegruppen zugeordnet werden. Die Sorten wiesen auch bei den Labortests eine erhöhte Anfälligkeit auf (Tab. 4). Eine Ausnahme stellte die Sorte ‘Sarpo Mira‘ dar, die zwar gute Resistenzeigenschaften mit sich bringt, aber für den deutschen Markt deutlich zu spät abreift.

Die Ergebnisse der verschiedenen Labortests und der Feldprüfung wiesen eine hohe Korrelation auf (Tab. 5). Einzig die Reife war mit keinem weiteren Merkmal korreliert.

Bei der Testung auf Speiseeignung schnitt der Stamm 12797/9 vergleichsweise gut ab. Die übrigen Stämme waren insgesamt für Speisezwecke wenig geeignet.

Für die Assoziationsstudien wurden nach einer Filterung insgesamt 27.710 polymorphe Marker genutzt. In Abbildung 6 ist die Verteilung der Marker über die 12 Chromosomen der Kulturkartoffel dargestellt. Neun Marker mit geringen Markereffekten zwischen –0,13 und 0,12 waren mit dem Merkmal ΔrAUDPC-Wert assoziiert (-log₁₀(p)> 3,5). Sie befinden sich auf den Chromosomen 1, 7, 10 und 11 (Abb. 6).

Abb. 6. Manhattan-Plot (diplo-additive) für das Merkmal ΔrAUDPC. Das Signifikanzniveau ((-log₁₀(p)> 3,5) wurde durch die Kontrolle der False Discovery Rate von 5 % festgelegt. Die Differenzierung der Chro­mosomen ist durch die abwechselnde Färbung gegeben.

Da die Ergebnisse der Feld- und Labortests stark miteinander korrelieren, wäre es denkbar den Testumfang für zukünftige Stämme zu reduzieren. Eine Möglichkeit wäre, statt je zwei Tests für Kraut- und Knollenfäule nur noch jeweils einen Test zu verwenden.

Die genomweite Assoziationsstudie zeigt fünf QTL mit kleinen Effekten für das Merkmal P.i.-Resistenz der unter­suchten Zuchtstämme auf. Diese niedrige Zahl an Resistenzfaktoren wirft die Frage auf, ob es sich bei den QTL um R-Gene handeln könnte. Gegen eine solche Annahme spricht die Pathotypen-Zusammensetzung des in dieser Studie verwendeten Inokulums, welches alle elf bekannten R-Gene aus S. demissum überwindet. Die in dieser Studie beobachteten, resistenzwirksamen QTL reprä­sentieren somit wahrscheinlich anderweitige Resistenzfaktoren. Die durch diese Faktoren bedingte Krautfäuleresistenz der betroffenen Zuchtstämme ist in unseren Feldprüfungen bislang über mindestens vier Jahre wirksam geblieben und dürfte somit einen dauerhaften Resistenztypus darstellen.

Danan et al. (2011) schließen aus ihrer Metaanalyse von 19 unabhängigen Studien zur QTL-Kartierung von P.i.-Resistenz, dass resistenzbedingte QTL auf allen zwölf Chromosomen des Kartoffelgenoms vorliegen. In den einzelnen Analysen wurden jeweils, wie auch in dieser Studie, nur vereinzelte QTL nachgewiesen. Daraus lässt sich ableiten, dass die gesamte genetische Diversität der Kartoffel und ihrer kreuzbaren Wildarten sehr viele verschiedenen Resistenzquellen bereithält und es weiterer Forschung bedarf, die Wirksamkeit und Dauerhaftigkeit der betreffenden QTL zu untersuchen und züchterisch zu erschließen.

Mithilfe von Markern, die mit dem Merkmal ΔrAUDPC assoziiert sind, wäre es denkbar, bereits Pflanzen im Sämlingsstadium (F1) auf P.i-Resistenz zu selektieren. Da sich die Assoziation in dieser Studie allerdings als schwach erwies, sind weitere Studien angedacht.

Die in den bisherigen und folgenden Arbeiten generierten Daten zu molekularen Markern sollen in weiteren Analysen auch auf potentielle Zusammenhänge zur Knollenfäule untersucht werden. Überdies werden die beschrie­benen sowie weitere Zuchtstämme und Neuzüchtungen neben der P.i.-Resistenz auch auf ihre Nährstoffeffizienz untersucht (Projekt EffiKar).