Die Gesellschaft für Pflanzenzüchtung (GPZ), AG 17 Arznei- und Gewürzpflanzen veranstaltet regelmäßig Vortragstagungen zu allen Aspekten, die mit der züchterischen Optimierung von Arten aus dieser Nutzungsgruppe der Sonderkulturen in Verbindung stehen. Hierzu zählen Fragen zu Menge und Zusam­men­setzung sekundärer Metaboliten, zu agronomischen und phytopathologischen Merkmalen ebenso, wie zur Inkulturnahme von Arten, die bislang in Wildbeständen besammelt werden.

Die Veranstaltung am 10. und 11.06.2021 im Julius Kühn-Institut (JKI) in Quedlinburg umfasst sechs Vorträge mit einem Schwerpunkt zu Forschungsarbeiten bei Johanniskraut (Hypericum perforatum, Abbildung 1). Beiträge zu den Kulturen Kamille (Matricaria recutita) und Kümmel (Carum carvi) werden ebenfalls vertreten sein. Auch Entwicklungen zu einem modu­laren Trockner zur Trocknung von Arznei- und Gewürzpflanzen werden dargestellt.

Abb. 1. blühendes Johannis­kraut (Hypericum per­foratum) in einem artenreichen Feldrain am Rand des Campus Klein-Altendorf der Rheinischen-Friedrich-Wilhelms Universität Bonn

Ich freue mich auf die Informationen und die Diskussionen, die wir erforderlichenfalls auch Online führen werden.

(Quedlinburg, den 01.05.2021,
Dr. Frank Marthe)

Der Anbau von Arznei- und Gewürzpflanzen stellt in Deutschland eine wirtschaftlich interessante Nische der landwirtschaftlichen Produktion dar. Die Arznei- und Gewürzpflanzen haben eine kurze Vorratsdauer und müssen für die spätere Verwendung in der Lebensmittel-, Kosmetik-, Pharma- und Kräuterindustrie unbedingt konserviert und gelagert werden. Die Heil- und Gewürzpflanzen sollten sofort nach der Ernte getrocknet werden, um Qualitätsverluste zu vermeiden. Durch den Einsatz geeigneter Trocknungssysteme kann die Produktqualität gesteigert und die Verluste reduziert werden. Für etablierte Betriebe mit einer Anbaufläche von mehr als 50 ha sind in Deutschland verschiedene Trocknertypen auf dem Markt verfügbar. Für kleinere Erntemengen, wie sie für Einsteiger in die Arzneipflanzenproduktion typisch sind, fehlt es jedoch an wirtschaftlichen Lösungen auf dem Markt. Daher ist es Ziel dieser Arbeit einen praxistauglichen und kostengünstigen modularen Trockner (Abbildung 2) zu entwickeln. In Zusammenarbeit mit der Firma Innotech wurde inzwischen ein Prototyp gebaut. Durch den Einsatz von Trocknungsboxen (Abbildung 1) besitzt der Modultrockner eine hohe Flexibilität hinsichtlich einer steigenden Erntemenge bei einer Ausweitung der Anbaufläche, ausgehend von einer Anfangsfläche von 1 ha. Dieser Trockner hat eine Länge von 4,2 m, eine Breite von 2 m und eine Höhe von 3 m und kann mit 140 Boxen mit den Maßen 60×40×22 cm befüllt werden. Es besteht jedoch die Möglichkeit, die Trocknungsfläche um 14,4 m3 durch das zweite Modul (2,4×2×3 m) zu erweitern. Der Trockner ist auch für verschiedene Pflanzenarten, Verarbeitungsformen (z. B. ganze Pflanze, Stecklinge) und Pflanzenfraktionen (z. B. Blätter, Blüten, Wurzeln) geeignet. Um die Trocknungseffizienz zu erhöhen, ist der Modultrockner mit einer teilweisen Luftrückführung durch Frischluft ausgestattet. Durch Öffnen der Klappen wird die abgesaugte Luft mit Frischluft vermischt. Außerdem soll die Nutzung und Kombination verschiedener Wärmequellen möglich sein, um fossile Energie zu sparen. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass der Luftstrom und die Wärme gleichmäßig auf die einzelnen Boxen im Trockner verteilt werden, was auf das große Poten­zial dieses Trockners für die Anwendung in der Heil­pflanzenproduktion hinweist. Die Funktionalität des modularen Trockners wird von Mai bis August 2021 an der Universität Hohenheim systematisch in Bezug auf Handhabung, Luftstrom, Wärmeverteilung, Energieverbrauch sowie Gleichmäßigkeit und Qualität der getrockneten Produkte untersucht. Der Trockner wird auch bei unterschiedlichen Betriebsbedingungen (z. B. unterschiedliche Trocknungstemperaturen von 35, 55 und 75°C) für verschiedene Pflanzenformen (Ganzpflanzen und Stecklinge) getestet. Zusätzlich wird die Kapazität des Trockners für verschie­dene Fraktionen von Heilpflanzen (Blätter, Stängel, Wurzeln) untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie könnten Anfängern in der Heilpflanzenproduktion neue Perspektiven eröffnen, indem diese Details über das modulare Trockner­system als neuen Ansatz für die Trocknung liefern.

Fig. 2. Der modulare Trockner-Prototyp an der Universität Hohenheim (links) und die Trocknungsboxen im In­neren des Trockners (rechts)

Die deutlich gesunkenen Kosten im Bereich der Next Generation Sequencing (NGS)-Methoden ermöglichen auch deren Nutzung bei der Züchtungsforschung an Sonderkulturen wie den Arznei- und Gewürzpflanzen. Das Genotyping by Sequencing (GBS) ist eine NGS-Methode zur Genotypisierung einer hohen Anzahl an Genotypen (Elshire et al., 2011). Durch den Einsatz von Restriktionsenzymen wird eine Genomreduktion vorgenommen. Nichtsdestoweniger wird durch GBS eine hohe Genomabdeckung erreicht. Zur Auswertung der Sequenzdaten ist ein Referenzgenom zwar vorteilhaft, jedoch nicht zwingend erforderlich. Dies ist wichtig, weil für die meisten Arznei­pflanzen, wie Kümmel noch kein Referenzgenom vorliegt. Üblicherweise werden GBS-Daten zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) genutzt, es kann aber auch ein Screening auf Simple Sequence Repeats (SSRs) durchgeführt werden. Beide Marker-Typen sind co-dominant, das heißt sie ermöglichen die Unterscheidung des heterozygoten Zustands von beiden homozygoten Zuständen in einem biallelen Kontext.

Im Kümmelprojekt von 2017 bis 2020, gefördert durch das Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft auf­grund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages über die Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe (FNR) (FNR: FKZ22023215) haben wir uns aufgrund der vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten für die Durchführung eines GBS entschieden. Zentrale Ziele waren die Aufklärung der Populationsstrukturen und der genetischen Diversität innerhalb verfügbarer Kümmelakzes­sionen, die Detektion von Marker-Merkmalsassoziationen und die Analyse der Auskreuzungsrate mittels eines co-dominanten Marker-Systems. Insgesamt wurden 137 Akzessionen genotypi­siert. Siebzig Akzessionen waren zweijährig und 67 einjährig, das heißt ohne Vernalisationsbedarf. Auf Basis der GBS-Reads wurde zunächst eine sogenannte „Mock-Reference“ erstellt (Clustering), was notwendig ist, wenn kein Referenzgenom vorliegt. Letztendlich führte die weitere Auswertung zur Detektion von 13.155 SNPs mit allen gewünschten Qualitätseigenschaften. Auch wenn sich das SNP-Set für die weiteren Analysen als äußerst geeignet erwies, wurden doch auch einige Nachteile der GBS aufgedeckt (Kim et al., 2016). So enthielten viele Marker Fehlstellen und eine unnatürlich hohe Heterozygotie wurde detektiert, was auf Fehler im Clustering zurückzuführen sein könnte. Generell dürfte eine GBS deutlich mehr und qualitativ hochwertigere SNP-Marker liefern, wenn ein Referenzgenom vorliegt.

Zuerst wurde das SNP-Set zur Analyse der Populationsstrukturen verwendet wurde (von Maydell et al., 2021). Es wurde ein Bayesisches Clustering (STRUCTURE), eine Hauptkoordinatenanalyse und ein Neighbor-Joining durchgeführt. Alle Analysen zeigten die Aufspaltung der Akzessionen in zwei Subpopulationen, die weitgehend deckungsgleich mit dem Blühtyp waren. Zudem wurden generell die verwandtschaftlichen Beziehungen zwischen den Akzessionen aufgedeckt. Solche Infor­mationen sind wichtig in neuen Züchtungsprogrammen, um möglichst diverses Ausgangsmaterial für Kreuzungen und Selektionen zusammenzustellen. Berechnete Kennzahlen der genetischen Diversität zeigten eine ähnlich hohe Diversität im zweijährigen wie im einjährigen Genpool.

Die genotypisierten Akzessionen wurden in den Jahren 2018–2020 ebenfalls für wichtige Merkmale phänotypisiert. Dies ermöglichte die Durchführung einer Genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) zur Detektion von Marker-Merkmals-Assoziationen. Für die GWAS wurden mehrere Modelle getestet, die auf gemischt linearen Modellen (MLMs) basieren. MLMs erlau­ben die Einbeziehung sowohl der individuellen verwandt­schaftlichen Beziehungen zwischen den Akzessionen (kinship) als auch der Populationsstrukturen. Dies war in der vorliegenden genetisch strukturierten Population äußerst wichtig. Es wurden Marker-Assoziationen unter anderem mit Blühtyp, Ätherischölgehalt, Kornausfallrate und Tausendkorngewicht gefunden. Die gefundenen Marker sollten zunächst weiter in Kartierungspopulationen getestet werden, bevor diese in der Marker-gestützten Selektion (MAS) eingesetzt werden können. Die Nutzung von MAS wäre ein Meilenstein für die Züchtungsforschung an Kümmel.

Für die MAS ist die Überführung der SNP-Marker in ein diagnostisches Marker-System erforderlich. Das PACE-Marker-System (ähnlich zu KASP) ist hier ein gutes, Hochdurchsatz-geeig­netes System, das mittels einer qPCR-Plattform durchgeführt wird. Auf Basis von GBS-Daten konnte dieses für Kümmel unkom­pliziert implementiert werden (von Maydell et al., 2020). In diesem Fall wurden die Marker zur Bestimmung der Auskreuzungsrate genutzt, die für Kümmel bis dato unbekannt war. Im Mittel wurde eine Auskreuzungsrate von 66.5 % und eine hohe Variabilität zwischen den Genotypen gefunden. Kennt­nis der Auskreuzungsrate ist wichtig zur Auswahl einer geeigneten Züchtungsmethode.

Zusammenfassend erwies sich die GBS als sehr robuste Geno­typisierungs-Methode mit vielen Anwendungsmöglichkeiten und nur kleineren Schwächen, die durch die hohe Anzahl an Markern ausgeglichen wurden. Während für die Bearbeitung einzelner wissenschaftlicher Fragestellungen klassische Marker-Systeme noch günstiger sein können, dürfte sich GBS als nachhaltig und kosteneffizient erweisen, wenn die Daten für eine Vielzahl an Analysen genutzt werden.

Gefördert durch das Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestags über die Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe

Die Echte Kamille, Matricaria recutita L., ist eine der wichtigsten Arzneipflanzen mit einer langen Tradition zur Behandlung diverser Beschwerden wie Infektionen und Entzündungen der Haut, gastrointestinale Beschwerden und Atemwegsprobleme. Neben ihrer wirtschaftlichen Bedeutung trägt der Anbau der Kamille zur Agrobiodiversität bei. Kamille wird zwar auf ca. 1.100 ha in Deutschland angebaut, doch deckt dies nur einen kleinen Teil des Bedarfs. Eine Stabilisierung und Ausweitung des Anbaus von Arznei- und Gewürzpflanzen in Deutschland und damit aufgrund der Bedeutung insbesondere auch von Kamille ist wünschenswert. Neue Flächen lassen sich allerdings nur schwer gewinnen, da die Samen 10 – 15 Jahre im Boden keimfähig bleiben und Kamille als Beikraut schwer zu bekämpfen ist. Auf den vorhandenen Flächen findet eine Akkumulation der Kamillenkrankheiten statt, da der Fruchtwechsel ausbleibt. In den letzten Jahren sorgt neben Echtem und Falschem Mehltau sowie Septoria matricariae ein neuer Schadpilz, Rhexocercosporidium sp. nov., im Anbau für Ertragseinbußen (FNR-Pressemitteilung, 23.03.2021).

Eine sterile Sorte erzeugt durch interploide Kreuzungen, vergleichbar den etablierten triploiden sterilen Sorten in der Obst- und Zierpflanzenzüchtung, wäre eine Lösung für diese Pro­blemstellung, da die unreifen Blütenköpfe der Kamille vor der Samenbildung geerntet werden. Die Fremdbefruchtungsrate bei Kamille wurde auf ca. 70 % bestimmt, bei hoher genotypabhängiger Variabilität und einem gewissen Umwelt- bzw. Standorteinfluss. Da Kamille somit nur ein überwiegender Fremd­befruchter ist, müssen für die notwendige Bestäubungs­lenkung bei der Erzeugung steriler triploider Pflanzen Selbstungen ausgeschlossen werden. Hierzu wurden verschiedene Wege verfolgt, stabile männlich sterile und weiblich fertile Mutterlinien zu entwickeln: Selbstinkompatibilität (SI), kerngenetisch-männliche Sterilität (MS) sowie cytoplasmatisch männliche Sterilität (CMS). Des Weiteren wurde die chemische Kastration mit verschiedenen Gametoziden sowie der Einfluss von hohen Temperaturen während der Blüte untersucht, die allerdings nicht zu einer ausreichenden MS geführt haben. Es gelang, Pflanzen zu identifizieren, die bei wiederholten Selbstungen keinen Kornansatz zeigten. Die SI scheint allerdings stark von Umweltfaktoren abhängig und damit schwer kontrollierbar zu sein. Während die Erzeugung von CMS durch Kreuzungen entsprechender Eltern noch in der Ent­wicklung ist, konnten spontan auftretende MS-Kamillen­pflanzen in zwei Populationen gefunden werden. Zwei MS-Linien wurden daraus gene­riert, eine in der diploiden Sorte 'Bona', die andere in einer tetra­ploiden italienischen Handelsherkunft. Nach Bestäubung mit MF-Pflanzen der glei­chen Linie betrug das Verhältnis von sterilen Pflanzen 26 % in der F₂-Generation/23 % in der F₃-Generation für die 'Bona'-Linie und 11 % in der F₂-Generation für die Handelsherkunft Italien. Diese Verhältnisse deuten auf einen rezessiven Vererbungsweg hin.

Um die genetische Basis der männlichen Sterilität zu entschlüsseln, wurden 159 Pflanzen beider Linien, d. h. 90 MS- und 69 MF-Pflanzen, mittels Genotyping-by-Sequencing (GBS) analysiert. Eine Analyse der genetischen Diversität mittels der Software STRUCTURE unter Verwendung der SNP-Marker zeigte, dass sich die italienische Herkunft deutlich von `Bona' unterscheidet. Um molekulare Marker zu identifizieren, die mit MS assoziiert sind, wurden die GBS-SNPs für eine genomweite Assoziationsstudie (GWAS) verwendet. Die bislang am stärksten mit MS assoziierten SNPs waren in 80–90 % der MS-Pflanzen vorhanden, wurden allerdings auch in 4–7 % der MF-Pflanzen nachgewiesen. Derzeit wird eine Transkriptom­analyse durchgeführt, um Unterschiede in der Genexpression zwischen 8 MS- und 4 MF-Pflanzen aufzudecken und damit die genetischen Faktoren und mögliche molekulare Marker für MS zu identifizieren. Das Transkriptom der Blütenköpfe jeweils 3 verschiedener Entwicklungsstadien wurde de novo mit der Galaxy-Pipeline assembliert. Erste Ergebnisse ergaben 490 hoch- und 263 herunterregulierte Gene.

Triploide Kamillenpflanzen als ein Weg zu einer sterilen Sorte wurden sowohl spontan entstanden in Sorten identifiziert, als auch durch gezielte interploide Kreuzungen zwischen di- und tetraploiden Pflanzen erzeugt. Die Charakterisierung von 16 daraus stammenden triploiden Genotypen im Vergleich zu deren di- und tetraploiden Geschwisterpflanzen zeigte die Eignung Triploider zur Entwicklung steriler Kamillensorten. Die triploiden Pflanzen hatten eine sehr hoch ausgeprägte bis vollständige Sterilität und erwiesen sich agronomisch als hin­rei­chend leistungsfähig. Der Ertrag war bei den Triploiden mindestens auf dem gleichen Niveau wie bei den Tetraploiden, mit einzelnen triploiden Genotypen von deutlich höherem Ertrag. Die Blühdauer als Merkmal, das die Länge des möglichen Erntefensters bestimmt, war von di-, tri- und tetraploiden Pflanzen im Durchschnitt als gleich zu bewerten.

Bei geschlossenem Feldanbau als sterile Population könnten ggf. bereits MS-Linien die Ziele einer sterilen Sorte erfüllen.

Im Rahmen der Arbeiten erfolgte erstmalig eine Analyse der genetischen Diversität von 30 Kamillensorten/-populationen verschiedener Herkunft mittels der NGS-Methode GBS. Mit 6.495 SNP-Markern wurde eine detaillierte Analyse der gene­tischen Diversität von insbesondere wirtschaftlich genutzten Herkünften durchgeführt. Diese zeigte, dass viele (14) der im Anbau verwendeten tetraploiden Herkünfte genetisch sehr ähnlich sind. Des Weiteren wurden durch genomweite Assoziationskartierung (GWAS) mit der Blühzeit und dem wichtigen Inhaltsstoff alpha-Bisabolol assoziierte SNP-Loci identifiziert, die zur Entwicklung entsprechender Marker für die Selektion in der Züchtung dienen können.

Momentan finden am IPK Gatersleben parallel Arbeiten statt, ein erstes Referenzgenom (draft genome assembly) für Kamille zu erstellen. Dieses wird für alle weiteren Forschungsaktivitäten bei Kamille hinsichtlich Genetik und Genomik eine sehr hilfreiche Ressource darstellen.

Mit allen insgesamt erzeugten Daten können neue Forschungs- und Züchtungsaktivitäten angestoßen werden, wie z. B. zur Züchtung von erforderlichen Krankheitsresistenzen bei Kamille oder zur Verbesserung des Inhaltsstoffprofile/-gehalts, um die aktuellen Probleme im Kamillenanbau in Deutschland zu adressieren.

In der modernen Pflanzenzüchtung stellt die Doppelhaploiden – Technik eine wichtige Methode dar, um in kurzer Zeit homozygotes Pflanzenmaterial aus Mikrosporen herzustellen. Über 200 Sorten von 12 verschiedenen Kulturarten wurden bereits mithilfe dieser Technik entwickelt, darunter vor allem Sorten von Raps, Gerste, Paprika, Reis und Weizen. In den letzten Jahren wurden die Bemühungen verstärkt für Medizinal­pflanzen diese Methodik zu nutzen. Für die Anwendung der Mikrosporen-Kultur erwiesen sich bisher nur wenige Spezies als geeignet. Als positive Beispiele sind hier Dill, Fenchel und Anis zu nennen, bei denen doppelhaploide Linien mit interessanten Eigenschaften bereits in Zuchtprogrammen genutzt werden. Die Antheren-Kultur konnte bereits bei vielen Medizinalpflanzen-Spezies erfolgreich etabliert werden. Jedoch besteht bei dieser Methode die Gefahr, dass der Ursprung einer Pflanzenregeneration das Antheren-Gewebe ist und nicht die Mikrosporen sind. Auch waren die wenigsten Protokolle effizient genug, um routinemäßig in Zuchtprogrammen eingesetzt zu werden.

Die Züchtung von Johanniskraut wird durch seine fakultativ apomiktische Befruchtung erschwert, Zuchtziele konnten durch Selektionszüchtung erreicht werden. Neue Eigenschaften können jedoch nicht konventionell über Kreuzungen eingebracht werden. Ein gezieltes Umschalten vom apomiktischen zum sexuellen Befruchtungstyp ist nicht möglich. Für eine Kombinationszüchtung müssen geeignete sexuelle Linien identifiziert werden. Apomiktische Linien sind sehr heterogen, rezes­sive Allele sind für die konventionelle Züchtung nicht oder nur schwer nutzbar. In homozygoten, doppelhaploiden Pflanzen können jedoch rezessive Allele zur Ausprägung gebracht werden, die phänotypische Variabilität wird dadurch erhöht. Das Ziel eines von der FNR gefördertes Projektvorhabens war die Etablierung eines Systems zur Herstellung von haploiden bzw. doppelhaploiden (DH) Johanniskrautlinien. Hierzu wird die prinzipielle Fähigkeit unreifer Pollenzellen (Mikrosporen) genutzt, über Androgenese zu haploiden Pflanzen regenerieren zu können. Es wurde die Anwendung sowohl der Antheren- als auch die Kultur isolierter Mikrosporen getestet.

Als Ausgangsmaterial für das Vorhaben stand uns eine Samm­lung unterschiedlicher Johanniskraut-Herkünfte zur Verfügung. Darunter befinden sich diploide, tetraploide und hexaploide Genotypen, Genotypen mit obligat apomiktischer und obligat sexueller als auch mit fakultativ apomiktischer Fort­pflanzung. Das durch Stressapplikation induzierte Umschalten der Entwicklung hin zur Androgenese kann von Veränderungen bestimmter cytologischer Marker begleitet werden, wie z. b. Vergrößerung der Zelle, Größenreduzierung der Stärkekörner und Zentrierung des Zellkerns. Mit der Induktion einhergehend wurde in Mikrosporen eine Veränderung der Chromatin-Modifikationen festgestellt. Histon – Modifikationen können auch durch Chemikalien ausgelöst werden, z. B. durch Trichostatin A, ein chemischer Inhibitor der Histon-Acetylase. In unseren Experimenten konnte Trichostatin A in Kombination mit einer Kühle-Vorbehandlung die Zellteilungsrate und die Bildung von Multizellstrukturen in der Mikrosporenkultur von Johannis­kraut erhöhen. Bei einem Genotyp wurde eine Weiterentwicklung bis zu globulären Embryo – Strukturen beobachtet. Die Ent­wicklung stagnierte jedoch in diesem Stadium.

In der Antheren-Kultur wurde u. a. Trichostatin A bzw. Abscisin­säure in Kombination mit einer Kühle-Vorbehandlung der Knospen getestet. Nach 4–5 Wochen bildeten sich erste Kalli an den Antheren aus. Nach weiteren 4 Wochen regenerierten Pflanzen aus den Kalli. Bisher konnten 437 Pflanzen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Bei 11 Pflanzen wurde der haploide Chromosomensatz im Vergleich zu den Ausgangs­pflanzen nachgewiesen. Da auch polyploide Regenerate nachgewiesen wurden, kann eine spontane Aufdopplung während der Regeneration nicht ausgeschlossen werden. Eine Mikro­satelliten-Analyse von 236 Pflanzen konnte jedoch keine rein doppelhaploiden Pflanzen nachweisen.

Unsere Ergebnisse unterstreichen die Möglichkeit einer erfolg­reichen Etablierung der DH-Technik bei Johanniskraut. Die Arbeiten werden momentan fortgeführt.

Die Gattung Hypericum ist eine Pflanzengattung innerhalb der Familie der Johanniskrautgewächse (Hypericaceae), die ca. 460 Arten umfasst – Sträucher, Kräuter und Bäume, und ist vor allem in den gemäßigten und tropischen Regionen der Welt verbreitet. Das Echte Johanniskraut (Hypericum perforatum) wird bereits seit der Antike als Heilpflanze verwendet, unter ande­rem für die Behandlung von Verbrennungen, Hautproblemen und Depressionen. Die medizinischen Wirkungen werden dabei den Sekundärmetaboliten, vor allem den Hypericinderivaten Hypericin und Pseudohypericin, zugeschrieben. Bei der Aufklärung der Hypericin-Biosynthese konnten durch Rizzo et al., 2019 neue Kenntnisse gewonnen werden: so erfolgt die Synthese aus Acetyl-CoA und Malonyl-CoA nun nicht mehr über den Präkursor Emodin, sondern über Penicilliopsin mit Hilfe von verschiedenen Enzymen wie OKS (octaketide synthase), PKC (polyketide cyclase) und POCP (phenol oxidative coupling protein). BBE (berberine bridge enzyme) katalysiert die weitere Umwandlung in Protohypericin, welches schließlich unter Lichteinwirkung nichtenzymatisch in Hypericin umgewandelt wird.

Zur Erlangung weiterer Erkenntnisse der allelischen Zusammensetzung und damit zur Synthese von Hypericin wurde eine neuartige Genotyping-by-synthesis (GBS)-Methode angewandt. Diese zielte darauf ab, Repeats, die bis zu 75 % eines Genoms ausmachen können, im Vorfeld der Sequenzierung aus dem Ansatz zu entfernen. Dazu wurden insgesamt 175 Genotypen von H. perforatum der geographischen Verbreitungsge­biete Griechenland, Alpenraum und Sachsen sowie 3 Genotypen von H. vesiculosum via GBS analysiert. Ausgehend von der Überlegung, dass genomische Abschnitte, die in die Hypericin-Synthese involviert sind, in den beiden untersuchten Arten H. perforatum und H. vesiculosum konserviert sein müssten, könnten Hypericin-spezifische Gene am ehesten unter den zwischen beiden Arten konservierten Loci zu finden sein. Bei unseren Analysen konnten ca. 64.000 Loci gefunden werden, die in beiden Arten zu finden waren, wobei 28 Loci identifiziert wurden, die Ähnlichkeit zu Genen des Hypericin-pathways nach Rizzo et al., 2019 aufwiesen. Ein Vergleich dieser Daten mit microRNA-Daten aus H. perforatum befindet sich gerade in Bearbeitung und könnte weitere Einblicke in die Biosynthese von Hypericin liefern.

Bei der chemischen Analyse des Pflanzenmaterials verschiedener Hypericum-Arten zeigte sich weiterhin, dass Hypericum-Pflanzenmaterial als effizienter Katalysator in typischen photoredox-katalysierten Reaktionen eingesetzt werden kann. Hier­bei wurden erfolgreich Photoreduktions- sowie Photooxidationsreaktionen durchgeführt. Die Konstitutionsanalyse verschiedener Hypericum-Arten zeigte, dass ein hoher Hypericin Gehalt, wie in H. vesiculosum, die Photoredoxreaktionen beson­ders begünstigen. Der Einsatz von getrocknetem Hypericum Pflanzenmaterial als aktiver und erneuerbarer Katalysator ist eine nachhaltige Alternative zu bisher verwendeten Metall basierten Chromophoren und wurde erfolgreich zum Patent angemeldet (DE 10 2019 215 871).

Hypericum perforatum (Saint John’s Wort) is one of the most common medicinal plants available in the international market (Crockett & Robson, 2012; Klemow et al., 2011). The interest around this species mainly derives from two compounds: hyperi­cin and hyperforin. The first one is a naphthodianthrone known for its applications in cancer photodynamic therapy (Garg et al., 2012) and the treatment of Alzheimer’s disease (Hofrichter et al., 2013) while hyperforin is regarded as a mild antidepressant (Bhattacharya et al., 1998; Chatterjee et al., 1998; Müller, 2005).

We identified contrasting plant lines, which either develop or do not develop dark glands in their placental tissue (Rizzo et al., 2019).

Dark glands are organs specialized in the accumulation and compartmentalization of hypericin and other secondary meta­bolites (Rizzo et al., 2020). Previously, scientists studied dark glands in leaves to identify the genes involved in hypericin biosynthesis (Sotak et al., 2016a; Sotak et al., 2016b). Although this approach yielded interesting candidate genes, comparative transcriptomics across different leaf fractions is not an ideal experimen­tal design because it involves comparing different tissues characterized by different morphology.

We use the placental tissue as a model organ to address the transcriptome and metabolome associated with hypericin biosynthesis. Our approach uses a combination of developmental characterization of plant lines with glanded and glandless placental tissues via multi-stage comparative transcriptomics. We identified a shortlist of genes whose expression is strictly synchronized with hypericin accumulation in the dark glands. This led to an updated version of the proposed hypericin biosynthesis. Furthermore, we detected two transcription factors putatively associated with the differentiation of dark glands.

Our lab is currently establishing a transformation platform that will allow us to test our candidate genes and address biological questions regarding the causal connection between the differentiation of dark glands and downstream metabolic pathways.

On another line of research, we are interested in understanding the functional and structural signature of apomixis (asexual reproduction through seed). In the frame of our apomixis research, we have characterized the sexual and apomictic ovule development both at the morphological and transcriptome level (Rizzo, 2016). We identified an apomixis-related locus likely derived by the assembly of gene fragments of an ancestral sexual genome (Schallau et al., 2010). Furthermore, we detected the differential expression of genes putatively involved in a series of developmental deregulations that, according to our hypothesis, trigger the deviation from a sexual to an apomictic way of reproduction (Rizzo, 2016).

At the IPK we rely on a vast collection of Hypericum germplasm that includes genotypes of different genetic backgrounds from different continents.