Einsatz der dCAPS-Technologie zur Differenzierung von Trp574-Leu und Ser653- Asn in Blattproben von Raps und Clearfield<sup>®</sup>-Raps

Autor/innen

  • Alexander Proges
  • Hans-Jörg Jacobsen
  • Jean Wagner

DOI:

https://doi.org/10.5073/jka.2012.434.018

Abstract

Bei Clearfield®-Raps (Brassica napus L.) handelt es sich um Rapssorten, in denen eine Unkrautbekämfung mit Herbiziden aus der Gruppe der ALS-Inhibitoren möglich ist. Zwei Allele der ALS (Acetolactat-Synthase), die eine Target-Site Resistance (wirkortspezifische Resistenz, bzw. Toleranz) bewirken, sind in zwei der fünf ALS-Gene des Raps eingekreuzt. Der Clearfield®-Raps differenziert sich vom konventionellen Raps durch die Aminosäure Asparagin an Stelle von Serin im Kodon 653 des ALS I Gens und bewirkt eine erhöhte Toleranz speziell gegen Herbizide aus der Gruppe der Imidazolinone. Das Allel von ALS III differenziert sich durch die Aminosäure Leucin an Stelle von Trypthophan im Kodon 574 und bewirkt eine Toleranz hauptsächlich gegen Imidazolinone, Sulfonylharnstoffe und Triazolopyrimidine (gruppenübergreifende Toleranz). Letzteres ist für eine erschwerte Bekämpfung von Clearfield®-Raps als Ausfallraps mit Sulfonylharnstoffen und Triazolopyrimidinen z.B. in Getreide verantwortlich. In dieser Arbeit wird ein Test vorgestellt, der eine Allel-Diskriminierung mittels der dCAPS-Technologie (derived cleaved amplified polymorphic sequence) ermöglicht. So lässt sich ein Clearfield®- Raps von einem konventionellen Raps an Blättern und anderen Pflanzenteilen mittel Molekulargenetik differenzieren. Durch eine Kombination von PCR und der Behandlung der PCR-Produkte durch spezifische Restriktionsendonukleasen werden die Resistenz-Allele auf dem ALS I (nach Behandlung mit MnlI) und ALS III (nach Behandlung mit NcoI) mittels Gelelektrophorese nachgewiesen. Für den Nachweis einer Minderwirkung von Sulfonylharnstoffen gegen Ausfallraps reicht oft die Identifizierung von Leu574 aus. Um sicher zu gehen und einen Clearfield®-Raps von natürlich auftretenden Raps-Varianten mit einer Resistenz zu unterscheiden sollte immer auch ein Nachweis von Asn653 durchgeführt werden. Die hier dargestellte Technik setzt keine spezielle Laboreinrichtung voraus und lässt sich mit molekulargenetischen Grundkenntnissen etablieren. So können landwirtschaftliche Einrichtungen flexibel auf einen Nachweisbedarf von Clearfield®-Raps in der Praxis reagieren.

Stichwörter: Ausfallraps, Auskreuzung, Clearfield®, dCAPS, Herbizidtoleranz, Imidazolinone, Leu574, Ser, SNPs, Sulfonylharnstoffe, Triazolopyrimidine, Unkrautbekämpfung

The utilization of the dCAPS technology to discriminate Trp574-Leu and Ser653-Asn in leaf samples of Clearfield® oilseed rape and conventional oilseed rape

Clearfield® rape (Brassica napus L.) derives from classical breeding methods and makes weed control with ALS-inhibiting herbicides in oilseed rape possible. Two alleles of the ALS (acetolactate synthase), which are responsible for target site resistance (or tolerance, respectively), were crossed into two of the five ALS genes of oilseed rape. The allele of Clearfield® oilseed rape in ALS I is different from other ALS alleles by an exchange of the amino acid serine by asparagine in the codon 653 and is responsible for tolerance to imidazolinones. The allele in ALS III differs by an exchange of tryptophan to leucine in the codon 574 and causes a broad tolerance to imidazolinones, sulfonylureas, and triazolopyrimidines. The latter allele hinders mainly the control of volunteer Clearfield® oilseed rape with sulfonylureas and triazolopyrimidines e.g. in cereals. To decipher the alleles in Clearfield® oilseed rape and conventional oilseed rape a test based on the dCAPS (derived cleaved amplified polymorphic sequence) technology was developed and is presented here. With this test a Clearfield® oilseed rape can be discriminated in leaf samples or other parts of plants from conventional oilseed rape.

A combination of PCR and digestion with restriction endonucleases is used to discriminate the alleles of ALS I (after incubation of PCR-products with MnlI) and of ALS III (after incubation of PCR-products with NcoI). The identification of Leu574 is in most cases probably sufficient for proving reduced efficacy of sulfonylureas and triazolopyrimidines. To come to a clear identification and to discriminate Clearfield® oilseed rape from natural occurring target-site resistant oilseed rape both alleles should be analysed in samples. The dCAPS technology does not require special lab equipment and can be performed with the basic equipment of every molecular biological working lab. With the herein presented protocol the agricultural consulting and research facilities can react flexible on the need to prove Clearfield® oilseed rape variations from conventional oilseed rape in practice.

Keywords: dCAPS, herbicide tolerance, imidazolinone, outcrossing, single nucleotide polymorphism, sulfonylureas, triazolopyrimidines, volunteer rape, weed control

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Veröffentlicht

2012-03-06

Ausgabe

Rubrik

Herbizidresistenz bei Unkräutern / Herbicide resistance in weeds